Schwanzproteine ​​des Phagen SU10 reorganisieren sich zur Genomabgabe in die Düse

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5622 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Escherichia coli-Phage SU10 gehört zur Gattung Kuravirus aus der Klasse Caudoviricetes von Phagen mit kurzen, nicht kontraktilen Schwänzen. Im Gegensatz zu anderen Phagen mit kurzem Schwanz verlängern sich die Schwänze von Kuraviren bei der Zellanheftung. Hier zeigen wir, dass das Virion von SU10 einen verlängerten Kopf hat, der Genom- und Auswurfproteine ​​enthält, und einen Schwanz, der aus Portal-, Adapter-, Düsen- und Schwanznadelproteinen besteht und mit langen und kurzen Fasern verziert ist. Die Bindung der langen Schwanzfasern an die Rezeptoren in der äußeren Bakterienmembran induziert die Begradigung der Düsenproteine ​​und die Rotation der kurzen Schwanzfasern. Nach der Neuanordnung wechseln sich Düsenproteine ​​und kurze Schwanzfasern ab und bilden eine Düse, die den Schwanz um 28 nm verlängert. Anschließend löst sich die Schwanznadel von den Düsenproteinen und fünf Arten von Auswurfproteinen werden aus dem SU10-Kopf freigesetzt. Die Düse mit der mutmaßlichen Verlängerung, die durch die Auswurfproteine ​​gebildet wird, ermöglicht die Abgabe des SU10-Genoms in das bakterielle Zytoplasma. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Mechanismus der Genomübertragung, der die Bildung der Schwanzdüse beinhaltet, bei allen Kuraviren zum Einsatz kommt.

Phagen der Gattung Kuravirus gehören zur Klasse der Caudoviricetes der Phagen mit kurzen, nicht kontraktilen Schwänzen1. Kuraviren, einschließlich des Escherichia coli-Phagen SU10, zeichnen sich unter den Kurzschwanzphagen durch große Genome mit 75–80.000 Basenpaaren aus, die mehr als 50 Proteine ​​kodieren 2,3,4. Kuraviren sind lytisch, und einige von ihnen haben kurze Replikationszyklen und produzieren zahlreiche Nachkommen, was sie zu Kandidaten für den Einsatz in der Phagentherapie gegen pathogene E. coli-Stämme macht5,6,7. Ein Phagencocktail, der den Phagen ES17 aus der Gattung Kuravirus enthielt, wurde in einer Fallstudie zur Behandlung von E. coli-Infektionen der Prostata und der Harnwege verwendet8.

Die Genome von Kuraviren sind in gestreckten Köpfen untergebracht, die durch fünfzählige Symmetrie und Verlängerung in Richtung der Schwanzachse gekennzeichnet sind2,3. Die Genome von Schwanzphagen werden durch molekulare Motoren durch einen Kanal, der durch das Dodecamer von Portalproteinen gebildet wird und ein Pentamer von Kapsidproteinen an einer der fünf Spitzen des Kapsids ersetzt, in vorgeformte Pro-Köpfe verpackt. Phagenschwänze sind an den Portalkomplexen befestigt9. Häufige Schwanzkomponenten von Phagen mit kurzen Schwänzen, die gramnegative Bakterien infizieren, sind Adapterproteine, Hauptschwanzproteine, Schwanznadelproteine ​​und Schwanzfasern10. Die Schwanzfasern ermöglichen die anfängliche Bindung von Phagen an Bakterien11,12,13, während Schwanznadeln für das Eindringen in die äußere Membran der Wirtszelle verantwortlich sind14,15. Die Köpfe der meisten Kurzschwanzphagen enthalten Auswurfproteine, die den Transport von Phagengenomen in die Wirtszellen ermöglichen. Die Auswurfproteine ​​bilden einen Translokationskomplex, der den Schwanz verlängert, um die bakterielle Zellwand zu überspannen 16,17,18,19. Der Druck im Phagenkopf ermöglicht den Auswurf von 30–50 % des Genoms in eine Bakterienzelle20,21,22. Nach dem Druckausgleich im Phagenkopf und im bakteriellen Zytoplasma muss der Rest der DNA jedoch über einen anderen Mechanismus in das Bakterium transportiert werden21,23,24. Mithilfe der Negativfärbungs-Elektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass der Phagen SU10 einen längeren Schwanz hat als die meisten Phagen, die früher zur Familie der Podoviridae gehörten, und dass der Schwanz bei der Bindung an Bakterien eine Konformationsänderung erfährt2.

Hier präsentieren wir Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Strukturen des Virions und Genomfreisetzungszwischenprodukts des Bakteriophagen SU10 sowie Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) Charakterisierung seiner Bindung an E. coli-Zellen. Nach der Bindung an den Wirt ordnen sich SU10-Schwanz, Düsenproteine ​​und kurze Fasern neu an, um eine Düse zu bilden, die den Schwanz verlängert. Kuraviren weisen in ihren Schwanzproteinen eine Sequenzähnlichkeit von über 70 % auf. Daher ist es wahrscheinlich, dass dieser Mechanismus der Genomübertragung, der die Bildung der Schwanzdüse beinhaltet, von den meisten, wenn nicht allen Kuraviren genutzt wird.

Das Virion des Bakteriophagen SU10 hat einen prolaten Kopf mit einer Länge von 1430 Å und einem Durchmesser von 460 Å, der vom Hauptkapsidprotein (gp9) gebildet wird (Abb. 1a, Ergänzungstabelle 1, 2)2. Der Schwanz ist 220 Å lang und mit sechs langen und sechs kurzen Schwanzfasern verziert (Abb. 1a – c, 2a, c, Ergänzungstabelle 1, 2). Der Schwanz ist an einer der Spitzen des prolaten Kapsids befestigt, wo das Dodecamer der Portalproteine ​​(gp6) ein Pentamer der Kapsidproteine ​​ersetzt (Abb. 1a – c). Der aus dem Kapsid herausragende Teil des Portalkomplexes ermöglicht die Bindung des Dodecamers der Adapterproteine ​​(gp11). Der Adapterkomplex stellt sechs Bindungsstellen für Langschwanzfasern bereit, die jeweils aus einem Trimer proximaler Langschwanzfaserproteine ​​(gp12) und einem Trimer distaler Langschwanzfaserproteine ​​(gp13) bestehen (Abb. 1c, 2a, c). . Ein Hexamer aus Düsenproteinen (gp17) ist an den Adapterkomplex gebunden und ermöglicht die Bindung von sechs Kurzschwanzfasern, Trimeren des Kurzschwanzfaserproteins (gp16) (Abb. 2a, c). Die Schwanznadel, die aus drei Polypeptidketten (gp18) besteht, ragt aus dem zentralen Kanal hervor, der von den Düsenproteinen gebildet wird (Abb. 1a–c und 2a, c).

a Oberflächendarstellung einer zusammengesetzten Kryo-EM-Karte des Virions des Phagen SU10, gefärbt nach Proteintyp. Das Hauptkapsidprotein (gp9) ist in Türkis dargestellt, Portalprotein (gp6) in Magenta, Adapterprotein (gp11) in Gelb, lange Schwanzfasern (gp12) in Violett, Düsenprotein (gp17) in Rot, kurze Schwanzfasern (gp16). ) in Grün und Schwanznadel (gp18) in Hellblau. Die Länge des Virions beträgt 1590 Å. Einzelheiten zur Konstruktion der zusammengesetzten Karte finden Sie im Abschnitt Materialien und Methoden. b Wie A, aber die vordere Hälfte der zusammengesetzten Karte des SU10-Kopfes wurde entfernt, um die Struktur des Genoms in Grau darzustellen. Der Einschub zeigt einen 2D-Klassendurchschnitt des SU10-Virions. Der Maßstabsbalken zeigt 45 nm an. c Zusammengesetzte Kryo-EM-Karte der Portal- und Schwanzkomplexe des SU10-Virions. Die Länge des Komplexes beträgt 540 Å. D Kryo-EM-Rekonstruktion von Portal- und Schwanzkomplexen aus einem SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukt. e Zusammengesetzte Kryo-EM-Karte des Genomfreisetzungszwischenprodukts von SU10. Die vordere Hälfte des Kopfes wurde entfernt, um die Struktur des im Kapsid verbliebenen Genoms zu zeigen. Der Einschub zeigt einen 2D-Klassendurchschnitt des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts. f Schematische Darstellung eines Segments des SU10-Genoms, das Strukturproteine ​​kodiert, farblich identisch mit den Proteinen in den Feldern a bis e. Weiß dargestellte Proteine ​​sind entweder nicht strukturell oder wurden in den Rekonstruktionen nicht identifiziert.

Cartoon-Darstellungen von Proteinen, die den Schwanz des SU10-Virions a, c und das Genomfreisetzungszwischenprodukt b, d bilden. Das Portalprotein (gp6) ist in Magenta, das Adapterprotein (gp11) in Gelb, das Langschwanzfaserprotein (gp12) in Violett, das Düsenprotein (gp17) in Rot, das Kurzschwanzfaserprotein (gp16) in Grün und die Schwanznadel dargestellt Protein (gp18) in Hellblau. a, b Ansichten senkrecht zur Schwanzachse und c, d Ansichten entlang der Schwanzachse in Richtung Phagenkopf. Beim SU10-Virion sind die kurzen Schwanzfasern zum Kapsid hin geneigt und die Schwanznadel ragt aus dem Schwanzkomplex heraus. Dem Genomfreisetzungszwischenprodukt von SU10 b, d fehlt die Schwanznadel und es enthält eine 277 Å lange Düse, die aus kurzen Schwanzfasern und Düsenproteinen besteht. Die Schwanznadel sowie die zentrale und rezeptorbindende Domäne der kurzen Schwanzfaser wurden mit dem AlphaFold2-Multimer modelliert und in die Kryo-EM-Karte eingepasst. Die restlichen Strukturen wurden in Kryo-EM-Rekonstruktionen eingebaut. Einzelheiten zur Strukturvorhersage und zum Aufbau finden Sie im Abschnitt Materialien und Methoden.

Das Prolatkapsid von SU10 ist mit fünffacher Symmetrie organisiert und besteht aus 715 Kopien des Hauptkapsidproteins, organisiert mit den Triangulationsparametern Tend = 4, Tmid = 20 (Abb. 3a, ergänzende Abb. 1, 2). Das Hauptkapsidprotein bildet zwei Arten von Kapsomeren: Pentamere und Hexamere. Der zentrale röhrenförmige Teil des Kapsids besteht aus 90 Hexameren, die in neun Schichten einer Helix mit zehn Eingängen angeordnet sind (Abb. 3a). Das Kapsid ist an beiden Enden mit Kappen verschlossen, die von den Hauptkapsidproteinen gebildet werden, die mit lokaler quasi-ikosaedrischer T = 4-Symmetrie organisiert sind. Der Verschluss der Kappen wird durch Pentamere ermöglicht, die im Gegensatz zu den flacheren Hexameren gebogen sind (Abb. 3a, ergänzende Abb. 1). Die Bildung des prolaten SU10-Kopfes erfordert jedoch auch Variationen in der Form der Hexamere und in den Winkeln, in denen sie interagieren. Die Hexamere in den Kappen sind stärker gebogen (H4, H5; 149–150°), wohingegen diejenigen, die den röhrenförmigen Teil des Kapsids bilden, relativ flach sind (H1, H2L, H2R, H3; 154–164°) (Ergänzende Abb. 2). Alle Hexamer-Hexamer- und Hexamer-Pentamer-Grenzflächen in den Kappen sind gewölbt (145°) (ergänzende Abbildung 2A). Die Hexamer, die den röhrenförmigen Teil des Kapsids bilden, sind jedoch durch zwei Arten von Grenzflächen verbunden, gewölbt (145°). und planarer (160°) (Ergänzende Abbildung 2). Die gewölbten Grenzflächen ermöglichen die Bildung von Ringen aus Hexameren, während die eher planaren Grenzflächen Wechselwirkungen zwischen den Ringen vermitteln (ergänzende Abbildung 2).

eine Cartoon-Darstellung von Proteinen, die das Virion des Phagen SU10 bilden. Das Prolatkapsid hat eine fünfzählige Symmetrie und die Kapsidproteine ​​sind mit den Parametern Tend = 4, Tmid = 20 organisiert. Pentamere von Kapsidproteinen werden in Orange dargestellt, Hexamere in dunklem Cyan oder hellem Seegrün. Es gibt zwei Arten von Pentameren, basierend auf ihrer Position im Kapsid. Das P1-Pentamer ist auf der fünfzähligen Achse des Partikels positioniert, während die übrigen P2-Pentamere auf quasi-fünfzähligen Achsen an den Grenzen zwischen dem röhrenförmigen Teil des Kapsids und den Kappen positioniert sind. Es gibt sechs Varianten von Hexameren: H1, das den zentralen Teil des Prolatkopfes bildet; H2L und H2R gehören zum zentralen Teil des Kapsids, interagieren jedoch mit den Endkappen; H3 liegt zwischen P2-Pentameren; H4 liegt zwischen P1- und P2-Pentameren; und H5 liegen zwischen P2-Pentameren und dem Portalkomplex. b Vergleich der Strukturen der wichtigsten Kapsidproteine, die H1-Hexamer (farbig entsprechend den Domänen) und P1-Pentamer (weiß) bilden. Das Hauptkapsidprotein von SU10 hat eine HK97-Faltung25,66. Die Hauptunterschiede in der Struktur der P1- und H1-Untereinheiten liegen im N-terminalen Arm, der erweiterten Schleife und der ringförmigen Schleife. Die Domänenorganisation des Hauptkapsidproteins wird als 1D-Diagramm dargestellt. c Cartoon-Darstellung der wichtigsten Kapsidproteine, die P2-Pentamer und H2R-Hexamer bilden. Zwei wichtige Kapsidproteine, die die meisten Kontakte zwischen Pentamer und Hexamer vermitteln, sind mit farblich hervorgehobenen Domänen dargestellt. Die übrigen Untereinheiten sind abwechselnd in Weiß und Dunkelgrau dargestellt. Die G-Loops aller Untereinheiten sind in Magenta hervorgehoben.

Das Hauptkapsidprotein von SU10 weist eine HK97-Faltung auf, die bei Schwanzbakteriophagen und Herpesviren häufig vorkommt (Abb. 3b)25. Gemäß der Konvention kann das Kapsidprotein in den N-terminalen Arm, die periphere Domäne, die erweiterte Schleife, die axiale Domäne und die glycinreiche Schleife unterteilt werden (Abb. 3b). Der Hauptunterschied zwischen den Kapsidproteinen, die Hexamere und Pentamere bilden, liegt in der Struktur der ringförmigen Schleife an der Spitze der axialen Domäne (Abb. 3b). Bei Hexameren ragt die ringförmige Schleife von der axialen Domäne weg (Abb. 3b, c). Die sechs ringförmigen Schleifen aus Untereinheiten, die ein Hexamer bilden, bilden einen Ring um seine quasi sechszählige Achse (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu ist bei Untereinheiten, die Pentamere bilden, die ringförmige Schleife um 90° zum Kapsidzentrum hin gebogen (Abb. 3c). Die Betastränge aus den Schleifen der Hauptkapsidproteine ​​eines Pentamers bilden ein Betafass mit einer zentralen Pore mit einem Durchmesser von 8 Å, die das Kapsid durchdringt. (Abb. 3c, ergänzende Abb. 3G). Die Pore kann beim Verpacken und Auswerfen des Genoms für den Durchgang von Ionen und Wassermolekülen vom und in das Kapsid dienen.

Das Genom von SU10 kodiert für ein Protein (gp10) mit einer vorhergesagten Immunglobulin-ähnlichen Faltung, die der des Nebenkapsidproteins des Phagen Epsilon15 und der N-terminalen Domäne des Kopffaserproteins des Bakteriophagen φ2926,27 ähnelt. Die Kryo-EM-Rekonstruktion des SU10-Kopfes enthält jedoch keine Dichte, die kleineren Kapsidproteinen entspricht. Es ist möglich, dass gp10 von SU10 eine andere Funktion hat oder mit geringer Affinität an das Kapsid bindet und während der Phagenreinigung verloren ging (ergänzende Abbildung 4C).

Die Kryo-EM-Dichte des Genoms im SU10-Virion wurde sowohl in fünffach symmetrischen als auch in asymmetrischen Rekonstruktionen seines Kopfes aufgelöst (Abb. 1b, ergänzende Abb. 3). Trotz der Unterschiede in den während der Rekonstruktionsprozesse auferlegten Symmetrien sind die Anordnungen der Genomdichten ähnlich (ergänzende Abbildung 3A – D). Innerhalb des röhrenförmigen Teils des Kopfes können neun dichte Schalen unterschieden werden, während unter den Kapsidkappen nur vier Schalen aufgelöst sind (ergänzende Abbildung 3). In den drei äußersten Schalen trennt sich die Dichte in Stränge, die als Segmente doppelsträngiger DNA interpretiert werden können (Ergänzende Abbildungen 3A – D, F). Die aufgelöste Struktur des Genoms in der Kryo-EM-Rekonstruktion weist darauf hin, dass die Genomverpackung in den meisten SU10-Virionen zu einer ähnlichen Reihenfolge der DNA führt. Allerdings werden Verbindungen zwischen den DNA-Segmenten im zentralen Teil des SU10-Kopfes, die bestehen müssen, weil das Genom aus einer einzelnen 77.325 bp langen doppelsträngigen DNA2 besteht, nicht aufgelöst. Sowohl bei fünffach symmetrischen als auch bei asymmetrischen Rekonstruktionen des SU10-Kopfes sind die DNA-Stränge in den beiden äußersten Schichten als Helices mit zehn Einträgen organisiert (ergänzende Abbildungen 3B, D). Die DNA-Stränge aus der äußersten Schicht des Genoms krümmen sich, um die Betafässer zu vermeiden, die aus Pentameren von Kapsidproteinen hervorstehen (ergänzende Abbildung 3G). Die faszinierende Organisation der DNA könnte als zusätzliche Einschränkung in zukünftigen Studien des Phagengenom-Verpackungsprozesses durch Computersimulationen genutzt werden.

Die Proteine ​​gp20-24 sind im SU10-Virion vorhanden, fehlen jedoch im Genomfreisetzungszwischenprodukt, was darauf hinweist, dass es sich um Auswurfproteine ​​handelt (Ergänzungsabbildung 4C, Ergänzungstabelle 1). Die Rekonstruktion des SU10-Virions enthält jedoch keine aufgelöste Dichte, die den mutmaßlichen Auswurfproteinen zugeschrieben werden könnte (Abb. 1b), wie dies bei den Schwanzphagen T7, Epsilon15 und N417,18,28 der Fall ist. Das Genom von SU10 ist im Kapsid mit einer Dichte von 0,48 Da/Å3 verpackt, was mit den zuvor für die Bakteriophagen P22, Lambda, T4, ϕ29 und T729 ermittelten 0,49–0,52 Da/Å3 vergleichbar ist. Daher könnte das Kapsid von SU10 sowohl genomische DNA als auch Auswurfproteine ​​enthalten.

Der Portalkomplex von SU10 ist an einer seiner fünffachen Spitzen in das Kapsid eingebettet und ersetzt dort ein Pentamer aus Kapsidproteinen (Abb. 1a, b, 4a). Das Portalprotein von SU10 kann in die Flügel-, Stamm-, Clip-, Kronen- und Fassdomänen unterteilt werden (Abb. 4b)29. Die Flügeldomäne ist die größte und besteht aus acht Helices und einem β-Sandwich, das zwei β-Faltblätter mit fünf und drei antiparallelen β-Strängen enthält (Abb. 4b). Die positiv geladenen Seitenketten von Lys3 und Lys5 aus der Flügeldomäne interagieren mit der DNA, die den Portalkomplex umhüllt (Abb. 4a). Die beiden Lysine werden im Portalkomplex zwölfmal wiederholt und bilden so eine hochavide Schnittstelle, die wahrscheinlich bald nach Beginn der Genomverpackung DNA bindet. Die Verankerung des DNA-Endes am Portal würde die Verpackung des Genoms im Kopf und seine endgültige Struktur beeinflussen. Darüber hinaus vermittelt die Flügeldomäne die Wechselwirkungen des Portalkomplexes mit dem Kapsid (Abb. 4a, c). Aufgrund der Nichtübereinstimmung der fünffachen Symmetrie des Kapsids und der zwölffachen Symmetrie des Portals haben wir ihre Wechselwirkungen mithilfe einer asymmetrischen Rekonstruktion der Halsregion des SU10-Virions charakterisiert, die eine Auflösung von 4,6 Å erreichte (Ergänzungstabelle 2). Die Reste 8–44 aus der Flügeldomäne bilden eine gekrümmte α-Helix, die die Innenseite des Kapsids auskleidet (Abb. 4a, b). Zusätzliche Wechselwirkungen zwischen Portal und Kapsid werden durch die Stammschleife der Flügeldomäne vermittelt (Abb. 4a, b). Die Tunnelschleife aus der Flügeldomäne verengt den Portalkanal von SU10 auf 33 Å (Abb. 4, ergänzende Abb. 5). Bei den Phagen T7 und P23-45 wurde gezeigt, dass die Tunnelschleifen den Portalkanal öffnen und so die Genomfreisetzung regulieren15,30. Die Tunnelschleifen im SU10-Virion und im Genomfreisetzungszwischenprodukt haben jedoch die gleiche Struktur. Daher ist es wahrscheinlich, dass ein anderer Mechanismus die Genomretention von SU10 gewährleistet (ergänzende Abbildung 5). Die Stammdomäne verbindet die Flügel- und Clipdomäne und erstreckt sich über die Kapsidschale (Abb. 4b). Die Clip-Domäne des Portalkomplexes reicht vom Kapsid aus und ermöglicht die Anbindung der Adapterproteine ​​(Abb. 4a).

eine Cartoon-Darstellung eines in Kapsid eingebetteten Portalkomplexes. Ein Portalprotein ist in Magenta dargestellt, die übrigen Untereinheiten abwechselnd in Weiß und Grau. Die Kryo-EM-Dichte des Kapsids ist in Türkis dargestellt, die der DNA in Grau. Die Dichte eines mutmaßlichen Endes des dsDNA-Genoms oder der Auswurfproteine ​​im Inneren des Zylinders des Portalkomplexes ist in Orange dargestellt. Die Karten von Kapsid und DNA werden bei 2σ bzw. 4σ angezeigt. b Cartoon-Darstellung einer Untereinheit des Portalproteins, gefärbt entsprechend der Domänenzusammensetzung. Die Domänenorganisation des Portalproteins wird als 1D-Diagramm dargestellt. c Wechselwirkungen des Portalkomplexes mit dem Kapsid, entlang der Schwanzachse von außerhalb des Partikels betrachtet. Portalproteine ​​werden abwechselnd in Rosa und Lila dargestellt, Kapsidproteine ​​in dunklem und hellem Türkis. Die Richtungen der Wirbelsäulenhelices aus den peripheren Domänen der Hauptkapsidproteine ​​und der N-terminalen Helices aus den Flügeldomänen der Portalproteine ​​sind mit Pfeilen hervorgehoben, um die Diskrepanz zwischen der fünfzähligen Symmetrie des Kapsids und der zwölfzähligen Symmetrie des Portals hervorzuheben.

Das Dodecamer der SU10-Adapterproteine ​​bildet die Schnittstelle zwischen dem Dodecamer der Portalproteine ​​und dem Hexamer der Düsenproteine ​​(Abb. 1c, 2a und 5). Das Adapterprotein von SU10 hat die gleiche Domänenorganisation wie die Phagen T7 und KP32: eine Helixbündeldomäne, eine Long-Tail-Fibre-Dock-Domäne und eine Umarmungsschleife (Abb. 5c)15. Eine umschließende Schleife aus Adapterprotein ist zwischen den Clipdomänen eines Paares benachbarter Portalproteine ​​eingeklemmt und bindet an Stammschleifen von zwei weiteren Portalproteinen, die im Uhrzeigersinn positioniert sind, wenn man den Portalkomplex von außerhalb des Kapsids betrachtet (Abb. 5f). Die Long-Tail-Fibre-Dock-Domänen zweier benachbarter Adapterproteine ​​unterscheiden sich in ihrer Struktur, da sie mit unterschiedlichen Teilen einer Long-Tail-Faser interagieren (Abb. 5a, b, d). Die SU10-Long-Tail-Fiber-Dock-Domäne ähnelt denen der Phagen T7 und KP32 (Ergänzende Abbildung 6)15,31, die Long-Tail-Fasern haben13,32. Im Gegensatz dazu fehlen den Adapterproteinen der Phagen P22 und Sf6, die keine Langschwanzfasern haben, die Dockdomänen der Langschwanzfasern (ergänzende Abbildung 6) 12, 27.

a, b Cartoon-Darstellung eines Adapterkomplexes mit sechs langen Schwanzfasern, gesehen entlang und senkrecht zur Schwanzachse. Zwei ausgewählte Adapterproteine ​​aus dem Dodecamer sind orange und gelb hervorgehoben. Die übrigen Untereinheiten werden abwechselnd in Weiß und Grau dargestellt. Jede der sechs langen Schwanzfasern wird durch ein Trimer von gp12-Proteinen (violett) gebildet. c Überlagerung von Strukturen zweier benachbarter Adapterproteine, die sich in der Konformation ihrer langen Schwanzfaser-Dock-Loops unterscheiden. Eines der Adapterproteine ​​ist entsprechend der Domänenzusammensetzung gefärbt. Die überlagerte Untereinheit ist weiß dargestellt. Die Domänenorganisation des Adapterproteins wird als 1D-Diagramm dargestellt. d Wechselwirkungen von Adapterproteinen mit Long-Tail-Fasern. Faserdockschleifen (grün) zweier benachbarter Adapterproteine ​​interagieren mit einer langen Schwanzfaser. Die drei Untereinheiten, die die lange Schwanzfaser bilden, unterscheiden sich durch violette Farbtöne. Der N-Terminus jedes Long-Tail-Fibre-Proteins einer Long-Tail-Faser geht einzigartige Wechselwirkungen mit dem Adapterkomplex ein. e Wechselwirkungen des Adapterkomplexes mit dem Kapsid, betrachtet entlang der Schwanzachse von außerhalb des Partikels. Adapterproteine ​​sind abwechselnd in Gelb und Orange dargestellt, Kapsidproteine ​​in Türkistönen. Die Richtungen der Wirbelsäulenhelices von den peripheren Domänen der Hauptkapsidproteine ​​und der Faserdockschleifen von Adapterproteinen sind mit Pfeilen gekennzeichnet, um die Symmetriefehlanpassung zwischen dem Kapsid und dem Adapterkomplex hervorzuheben. f Schnittstelle zwischen Portalproteinen und C-terminal umschließenden Schleifen von Adapterproteinen. Die Umarmungsschleife (orange) verläuft zwischen den Portalclipdomänen der Portaluntereinheit A (grau) und B (weiß), dann kreuzt sie den Stamm der Portaluntereinheit C (dunkles Magenta) und reicht zwischen der Flügelschleife (Cyan) der Untereinheit C und Stamm der Untereinheit D (rosa). Die benachbarten Adapterproteine ​​unterscheiden sich in der Struktur ihrer umschlingenden Schleifen. Die umschließende Schleife (gelb) des Adapterproteins mit der anderen Konformation verläuft zwischen den Portal-Clip-Domänen der Portal-Untereinheiten B (weiß) und C (dunkles Magenta), kreuzt dann den Stamm der Portal-Untereinheit D (rosa) und reicht dazwischen Flügelschleife (hellblau) der Untereinheit D (grau) und Stiel der Untereinheit E (rosa).

An den Seiten des Adapterkomplexes sind sechs lange Schwanzfasern befestigt (Abb. 1a–c, 2a und 5a, b). Die Langschwanzfaser von SU10 wird durch Trimere von proximalen (gp12) und distalen (gp13) Langschwanzfaserproteinen gebildet. Von der Helixbündeldomäne jeder zweiten Untereinheit des Adapterkomplexes zweigt eine lange Schwanzfaser ab (Abb. 2a, c und 5a, b). Die N-Termini von zwei proximalen Langschwanzfaserproteinen einer Faser erstrecken sich bis zur Oberfläche der Helixbündeldomäne des benachbarten Adapterproteins, die sich entgegen dem Uhrzeigersinn befindet, wenn man den Adapterkomplex von außerhalb des Kapsids betrachtet (Abb. 5b, d). Der N-Terminus des dritten proximalen Proteins der Langschwanzfaser bindet an die Dockdomäne der Langschwanzfaser des Adapterproteins, von dem die Faser abzweigt (Abb. 5d). Die Langschwanzfasern bilden zusätzliche Kontakte mit den Faserdockschleifen, die radial aus den Faserdockdomänen der Adapterproteine ​​herausragen (Abb. 5a, c, d). Der gewickelte Teil jeder Langschwanzfaser wird von Faserdockschleifen zweier benachbarter Adapterproteine ​​​​gehalten (Abb. 5a, d). Die Kryo-EM-Rekonstruktion des Schwanzes ermöglichte den Aufbau von 90 Resten vom N-Terminus des 786 Reste langen proximalen Schwanzfaserproteins (Abb. 2a, c und 5a, b). Der Rest der langen Schwanzfaser wurde wahrscheinlich aufgrund ihrer Flexibilität nicht aufgelöst. Elektronenmikroskopische Aufnahmen gereinigter Phagen zeigen, dass die lange Schwanzfaser 700 Å lang ist und ein Ellenbogengelenk enthält, das die Faser in 300 und 400 Å lange Segmente unterteilt (ergänzende Abbildung 4a, b).

Das am Adapter befestigte Hexamer aus Düsenproteinen ist mit sechs kurzen Schwanzfasern verziert und sein zentraler Kanal ist mit einer Schwanznadel verschlossen (Abb. 1a–c, 2a, c und 6). Gemäß der für den Phagen T715 festgelegten Konvention kann das Düsenprotein von SU10 in die Plattform-, Beta-Propeller- und Düsendomänen unterteilt werden (Abb. 6a – c). Allerdings weisen die Düsenproteine ​​von SU10 und T7 keine nachweisbare Sequenzähnlichkeit auf.

Cartoon-Darstellung des Hexamers von Düsenproteinen mit angehängten kurzen Schwanzfasern des SU10-Virions, betrachtet von außerhalb des Partikels entlang (a) und senkrecht (b) zur Schwanzachse. Die Düsenproteine ​​sind abwechselnd weiß und grau dargestellt, die kurzen Schwanzfasern grün. Eines der Düsenproteine ​​ist farblich hervorgehoben, wobei die Plattformdomäne in Orange, die Beta-Propeller-Domäne in Blau, das kurze Schwanzfaserdock in Magenta und vier Düsendomänen in Rot dargestellt sind. Die schwarze Pfeilspitze in Bild (b) zeigt die Wechselwirkung zwischen Düsendomäne 4 und der kurzen Schwanzfaser. c Vergleich der Strukturen von Düsenproteinen und Kurzschwanzfasern im SU10-Virion und Genomfreisetzungszwischenprodukt. Das Düsenprotein des Virions ist wie in den Bildern a und b gefärbt, und die drei gp16-Untereinheiten, die eine kurze Schwanzfaser bilden, sind durch Grüntöne gekennzeichnet. Die überlagerten Strukturen des Düsenproteins und der Kurzschwanzfaser aus dem Zwischenprodukt der Genomfreisetzung sind in Weiß bzw. Hellgrün dargestellt. Die Domänenorganisation des Düsenproteins wird als 1D-Diagramm dargestellt. d Vergleich der Strukturen von Beta-Propeller-Domänen aus Düsenproteinen des SU10-Virions und des Genomfreisetzungszwischenprodukts, dargestellt in Regenbogenfarben bzw. Weiß. Die siebenblättrige Beta-Propeller-Domäne ist vom N-Terminus in Blau bis zum C-Terminus in Rot regenbogenfarben. Die Kurzschwanzfaser-Dockschleife ist eine Erweiterung von Blatt 1 (β1), während die Düsendomänen zwischen Blatt 2 (β2) und Blatt 3 (β3) eingefügt sind. e Wechselwirkungen der Kurzfaser-Dockschleife (Magenta) mit drei Kurzschwanzfaserproteinen (Grüntöne). Die Seitenketten von Trp839, Trp847 und Trp857 aus der Kurzfaser-Dock-Schleife bilden einen Stern mit quasi-dreizähliger Symmetrie, der die Anlagerung der Kurzschwanzfaser, einem Trimer, ermöglicht. Die Reste Tyr23, Ile24 und Tyr25 jedes Kurzschwanzfaserproteins klemmen ein Segment der Faserdockschleife vor jedem der Tryptophane fest.

Die Plattformdomäne weist eine Beta-Sandwich-Faltung auf, wobei die beiden Beta-Faltblätter aus fünf bzw. drei Beta-Strängen bestehen (Abb. 6c). Die Plattformdomäne jedes Düsenproteins interagiert mit den Helixbündeldomänen zweier benachbarter Adapterproteine. Die unterschiedlichen Wechselwirkungen der Düsenproteine ​​führen nur zu minimalen Unterschieden in der Struktur der benachbarten Adapterproteine.

Die siebenflügelige Beta-Propeller-Domäne hat einen Durchmesser von 50 Å und bildet den Kern des Düsenproteins (Abb. 6d). Die Blätter 4, 5 und 6 der Beta-Propeller-Domäne säumen den Heckkanal, während die Blätter 1, 2 und 3 von der Heckachse entfernt sind. Die Beta-Propeller-Domäne ist durch zwei Ein- und Austrittspunkte der Polypeptid-Hauptkette, sogenannte Öffnungen, unterbrochen. Die erste Öffnung in Blatt 1 umfasst den Eintritt der Hauptkette vom N-terminalen Teil der Plattformdomäne und den Ausgang der Hauptkette zum C-terminalen Teil der Plattformdomäne (Abb. 6d). Die Struktur von Blatt 1 des Beta-Propellers wird durch die antiparallele Wechselwirkung des äußersten Beta-Strangs, der durch C-terminale Reste der Domäne gebildet wird, mit den übrigen Strängen, die durch Reste vom N-Terminus der Domäne gebildet werden, stabilisiert , ein sogenannter Klettverschluss (Abb. 6d)33. Die zweite Öffnung wird durch das Einfügen von Düsendomänen zwischen den Beta-Propellerblättern 2 und 3 verursacht (Abb. 6d). An den Kanten der Blätter 4 und 5 vorstehende Schlaufen ermöglichen das Binden der Schwanznadel. Die Schleifen weisen im Zwischenprodukt der Genomfreisetzung unterschiedliche Konformationen auf, was zu einer Verbreiterung des Schwanzkanaldurchmessers von 25 auf 31 Å führt (ergänzende Abbildung 5). Die Kurzheckfaser-Dockschlaufe befindet sich am Rand von Blatt 1 der Beta-Propeller-Domäne und ermöglicht die Befestigung einer Kurzheckfaser (Abb. 6c – e).

Im SU10-Virion sind die Ig-ähnlichen Düsendomänen in einer L-förmigen Anordnung organisiert (Abb. 2a, 6a – c). Die ersten beiden Düsendomänen bilden eine stumpfe Schwanzspitze, dann erfolgt eine 82°-Drehung und die restlichen beiden Domänen zeigen in Richtung Kapsid (Abb. 6c). Die Kontakte zwischen Düsenproteinen werden durch die Plattform- und Beta-Propeller-Domänen vermittelt. Darüber hinaus wickeln sich die Düsendomänen um den Schwanz, und Düsendomäne 1 interagiert mit den Düsendomänen 2 und 3 des Düsenproteins, die sich im Uhrzeigersinn befinden, wenn man den Schwanz entlang seiner Achse in Richtung Kapsid betrachtet (Abb. 6a, b). Die Düsendomäne 4 interagiert mit der kurzen Schwanzfaser-Dockschleife des Düsenproteins, die sich gegen den Uhrzeigersinn befindet (Abb. 6a, b). Die vielfältigen Wechselwirkungen der Düsendomänen stabilisieren die native Struktur des SU10-Schwanzes.

Die kurze Schwanzfaser von SU10 hat eine Länge von 210 Å, ist gerade und kann in proximale, zentrale und rezeptorbindende Domänen unterteilt werden (Abb. 2, 6a – c, ergänzende Abb. 7). Die proximale Domäne wurde mit einer Auflösung von 3,8 Å rekonstruiert, was den Aufbau der ersten 98 Reste von gp16 ermöglichte (Abb. 6a – c, ergänzende Abb. 7). Die Alpha-Helices, die die proximale Domäne bilden, werden durch kurze Schleifen unterbrochen, die den Austausch der Positionen der Helices einzelner Untereinheiten innerhalb der Domäne vermitteln (ergänzende Abbildung 7). Die mit dem Programm AlphaFold2 Multimer modellierten zentralen und Rezeptorbindungsdomänen konnten in die Kryo-EM-Rekonstruktionen mit einer Auflösung von 7 bzw. 15 Å eingepasst werden, mit einem Korrelationskoeffizienten im realen Raum von 0,81 (ergänzende Abbildung 7A)34. Die zentrale Domäne ähnelt der Spitze der Kurzschwanzfaser des Phagen T4 (PDB: 1PDI) (Ergänzende Abbildung 7)35,36, wohingegen die Rezeptorbindungsdomäne der Spitze der Langschwanzfaser des Phagen T4 (PDB) ähnelt : 2XGF), das Lipopolysaccharide oder das Porinprotein C der äußeren Membran erkennt (ergänzende Abbildung 7)36. Darüber hinaus ähneln sowohl die zentrale als auch die Rezeptorbindungsdomäne den entsprechenden Teilen des Rezeptorbindungsproteins des gemäßigten Bakteriophagen JUB59 (PDB: 6OV6) (ergänzende Abbildung 7)37. Das SU10-Kurzschwanzfaserprotein enthält zwei Histidinpaare (His194 und His196, His230 und His232), die Fe2+-Ionen binden und so die Faser stabilisieren können, wie dies bei T4 und JUB der Fall ist5936,37,38,39.

Die kurze Schwanzfaser ist an einer Faserdockschleife eines Düsenproteins befestigt (Abb. 6c, e). Die Fiber-Dock-Schleife enthält die Tryptophane 839, 847 und 857, deren Seitenketten in einer pseudodreizähligen Symmetrie angeordnet sind (Abb. 6e). Jede Tryptophan-Seitenkette bildet hydrophobe Wechselwirkungen mit Ile24 von einem der drei Kurzschwanzfaserproteine ​​(Abb. 6e). Darüber hinaus klemmen die Seitenketten von Tyr23, Ile24 und Tyr25 jeder Kurzschwanzfaser ein Segment des Polypeptids vor den Tryptophanen der Faserdockschleife fest (Abb. 6e). Die Reste 3–6 der kurzen Schwanzfaser interagieren mit den Resten 303–308 der Düsendomäne 4 des Düsenproteins, die sich im Uhrzeigersinn befindet, wenn man entlang der Schwanzachse in Richtung Kapsid blickt (Abb. 6b). Die Position der Kurzschwanzfaser wird zusätzlich durch die Wechselwirkung der zentralen Domäne der Kurzschwanzfaser mit den Resten 71–78 der Langschwanzfaser stabilisiert (Abb. 1c, 2a, c). Es ist wahrscheinlich, dass die Störung dieser Wechselwirkungen die Koordination der Konformationsänderungen der langen und kurzen Schwanzfasern sowie der Düsenproteine ​​bei der Bindung von SU10 an die Wirtszelle ermöglicht.

Die Struktur der SU10-Schwanznadel mit auferlegter dreizähliger Symmetrie wurde mit einer Auflösung von 15 Å rekonstruiert (Abb. 1a – c, 2a, c, ergänzende Abb. 8). Die vom Alphafold2-Multimer vorhergesagte Struktur der Schwanznadel kann in Coiled-Coil- und C-terminale Domänen unterteilt werden und könnte mit einem Realraum-Korrelationskoeffizienten von 0, 80 in die Kryo-EM-Dichte eingepasst werden (ergänzende Abbildung 8A, B). Die Coiled-Coil-Domäne der SU10-Schwanznadel ist homolog zur Schwanznadel des Phagen P2214, die sich nachweislich bis zu 18°40 verbiegt. Daher gehen wir davon aus, dass die Schwanznadel von SU10 ähnlich flexibel ist, was möglicherweise der Grund dafür ist, dass wir sie nicht auf eine hohe Auflösung auflösen konnten. Die C-terminale Domäne weist eine Beta-Prisma-Struktur auf, die der der zentralen Schwanzspitzen von Myoviridae-Phagen ähnelt (Abb. 2a, c, ergänzende Abb. 8A, B)38,41,42. Die Bindung der SU10-Hecknadel an den Schwanzkanal wird durch zwei Schleifen an Blatt 4 und eine Schleife an Blatt 5 der Beta-Propeller-Domäne der Düsenproteine ​​​​ermöglicht (ergänzende Abbildung 8C, D). Die 260 Å lange Schwanznadel ragt 200 Å aus dem Düsenkomplex heraus (Abb. 1c, 2a, c).

Das Kapsid des Genomfreisetzungszwischenprodukts von SU10 ist identisch mit dem des Virions (Abb. 1, Ergänzungstabelle 3). Die Induktion der Freisetzung des SU10-Genoms in vitro durch osmotischen Schock führt zum unvollständigen Auswurf der Phagen-DNA (ergänzende Abbildung 4). Die Rekonstruktion des Kopfes des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts enthält Ringe mit mutmaßlicher DNA-Dichte, die an der Innenseite des Kapsids angebracht sind (Abb. 1e, ergänzende Abb. 9). Auch wenn die DNA-Dichte bei der Rekonstruktion des Genomfreisetzungszwischenprodukts in Ringen organisiert ist, handelt es sich bei der im Kopf verbleibenden DNA höchstwahrscheinlich um einen einzelnen zusammenhängenden Strang. Die Ringe sind Artefakte, die durch die Kombination aus struktureller Variabilität der DNA-Segmente in einzelnen Partikeln und ihrer Fehlausrichtung während des Rekonstruktionsprozesses entstehen. Die Neigung des SU10-Kapsids, DNA-Stränge zu organisieren, wie sie im Genomfreisetzungszwischenprodukt beobachtet wird, beeinflusst wahrscheinlich die Genomstruktur während der Verpackung.

Die asymmetrische Rekonstruktion der Kapsidkappe ohne Schwanz enthält eine kugelförmige Schale mit einer Dichte von 80 Å und einer Wandstärke von 15 Å (Ergänzende Abbildung 9C, E). Dieser Dichtebereich ist auch in zweidimensionalen Klassendurchschnitten der Genomfreisetzungszwischenprodukte sichtbar (ergänzende Abbildung 9F). Die Kugel ist nicht auf der fünfzähligen Symmetrieachse des Kapsids zentriert, sondern durch eine Dichte mit dem Beta-Fass verbunden, das durch ringförmige Schleifen von Hauptkapsidproteinen aus einem Pentamer gebildet wird (ergänzende Abbildung 9E). Die Position der Kugelschale der Dichte lässt eine Kante des Pentamers für die Bindung von DNA zugänglich (ergänzende Abbildung 9C). Die asymmetrische Rekonstruktion des SU10-Virions enthielt diese dichte Kugelhülle nicht, es ist jedoch möglich, dass die zur Auflösung der Kugelstruktur erforderliche asymmetrische Ausrichtung durch das starke Signal des Genoms verhindert wurde. Es ist nicht klar, was die beobachtete Kugelhülle der Dichte bildet. Der Radius der Kugel ist zu klein, als dass sie durch gebogenes dsDNA43 gebildet werden könnte. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Kugelschale durch Proteine ​​gebildet wird.

Der Schwanz des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts wird in die Düse umstrukturiert, die aus Düsenproteinen und kurzen Schwanzfasern besteht (Abb. 2c, d, 6c, ergänzende Abb. 5, ergänzender Film 1). Um die Düse zu bilden, durchlaufen die vier Düsendomänen eine umfassende Strukturänderung von der L-Form im SU10-Virion zur geraden Anordnung im Genomfreisetzungszwischenprodukt (Abb. 6c). In der neuen Konformation bilden die vier Domänen eine Linie, die vom Portalkomplex wegzeigt. Während die Wechselwirkung der Kurzschwanzfaser-Dockschleife mit einer Kurzschwanzfaser erhalten bleibt, drehen sich die Verbindungen der Kurzschwanzfaserschleife mit der Beta-Propeller-Domäne umeinander und biegen sich um 135°, um vom Phagenkopf weg zu zeigen (Abb. 6c, d). Die gleiche Drehung wird von der kurzen Schwanzfaser ausgeführt. In der neuen Anordnung wechseln sich Düsenproteine ​​und kurze Schwanzfasern ab und bilden eine Düse, die den Schwanz um 277 Å verlängert (Abb. 1d, 2b, d). Darüber hinaus verschiebt sich der distale Teil der Beta-Propeller-Domäne des Düsenproteins um 3 Å von der Schwanzachse weg, was zu einer Verbreiterung des Schwanzkanals führt (Abb. 6c, ergänzende Abb. 8C, D). Die Bildung der Düse ist erforderlich, um die Rezeptorbindungsdomänen der Kurzschwanzfasern in eine Position zu bringen, in der sie mit der Außenmembran von E. coli interagieren können.

Tomogramme von SU10-infizierten E. coli zeigen, dass mehrere Phagen ihre Genome binden und in eine Zelle abgeben können (Abb. 7a, ergänzende Abb. 10, ergänzender Film 2). Einige der Phagen waren nur durch lange Schwanzfasern befestigt, während die Schwänze der übrigen Phagen Düsen bildeten (Abb. 7a, ergänzende Abb. 10). Darüber hinaus befanden sich die Phagen mit Düsen in verschiedenen Stadien der Genomfreisetzung, vom vollen bis zum leeren Kopf. Die leeren Partikel blieben an der Zelloberfläche haften (Abb. 7a, ergänzende Abb. 10D – F). In den späten Stadien der SU10-Infektion enthielt die Probe äußere Membranvesikel mit gebundenen Phagenpartikeln (Abb. 7a, ergänzende Abb. 10J – L). Die Membranvesikel können von in Planktonkulturen wachsenden Bakterien abgestoßen werden44,45,46. Unter den in unseren Experimenten verwendeten Bedingungen der E. coli-Kultivierung sammelten sich 45 bis 65 Minuten nach der Infektion zahlreiche Nachkommenvirionen in den infizierten Zellen (ergänzende Abbildung 10J – L). Die wenigen anfänglich gebildeten Partikel waren zufällig verteilt, doch im Laufe der Zeit nach der Infektion sammelten sich die Nachkommen-Virionen zu regelmäßigen Anordnungen, wie bereits zuvor beschrieben2.

Ein Segment infizierter E. coli-Zellen 45 Minuten nach der Infektion enthält SU10-Phagen in verschiedenen Stadien des Infektionszyklus. Virionen außerhalb der Zelle sind in Türkis dargestellt, Zwischenprodukte der Genomfreisetzung mit gebildeten Düsen in Dunkelblau, leere Partikel in Cyan und Nachkommen-Virionen innerhalb der Zelle in Rot. Innere und äußere Zellmembranen sind in Dunkelorange bzw. Orange hervorgehoben, Vesikel in Hellorange, Ribosomen in Hellblau, Chemorezeptor-Array in Grün und Flagellum in Violett. Die Positionen von Phagenpartikeln, Ribosomen (EMD-13270) und dem Chemorezeptor-Array (EMD-10160) wurden mithilfe des in EMclarity64,65 implementierten Template-Matchings identifiziert und die entsprechenden hochauflösenden Strukturen im Tomogramm positioniert. b Schema des SU10-Virions. c Mechanismus der SU10-Anlagerung und Genomabgabe. (1) Das SU10-Virion bindet über lange Schwanzfasern an eine Zelloberfläche. (2) Durch die Bindung aller sechs langen Schwanzfasern wird der Phagen mit seiner Längsachse senkrecht zur Bakterienmembran positioniert. Die Schwanznadel kann mit der Außenmembran interagieren. (3) Die kurzen Schwanzfasern rotieren zur Zellmembran und die Düsenproteine ​​richten sich auf, um eine Düse zu bilden. (4) Die Schwanznadel löst sich vom Schwanz. Auswurfproteine ​​werden aus dem Phagenkopf freigesetzt, bauen Peptidoglycan der Zellwand ab und erweitern die Phagendüse, um einen Kanal durch das Periplasma zu bilden. Der Ausstoß von SU10-DNA in das bakterielle Zytoplasma wird eingeleitet. (5) Das leere Teilchen bleibt mit der Zelle verbunden.

Konfokale Airyscan-Bilder von E. coli-Zellen mit markierten Membranen und Genomen, die mit SU10 mit markierter DNA infiziert wurden, bestätigten, dass zahlreiche Phagenpartikel ihre Genome binden und in eine Zelle abgeben (Ergänzende Abbildung 10C – F). Das Fluoreszenzsignal der markierten Phagen-DNA war bis zur Zelllyse im Zellzytoplasma nachweisbar und wurde sogar in Nachkommenvirionen eingebaut (ergänzende Abbildung 10I, L). Die infizierten Zellen behielten 45 Minuten nach der Infektion ihre ursprüngliche Formeinheit, verloren jedoch nach 65 Minuten den Turgor (ergänzende Abbildung 10J – L).

Die anfängliche Bindung des SU10-Virions an Rezeptoren in der Außenmembran von E. coli wird durch lange Schwanzfasern vermittelt, die an ihren distalen Enden Rezeptorbindungsdomänen aufweisen (Abb. 7b, c). Die Strukturen des SU10-Virions und des Genomfreisetzungszwischenprodukts unterscheiden sich in der Richtung, in die die langen Schwanzfasern von den Adapterkomplexen weg zeigen (Abb. 2c, d). Die langen Schwanzfasern im Genomfreisetzungszwischenprodukt sind relativ zu ihrer Ausrichtung im Virion um 6,6° gedreht. Wir spekulieren, dass diese Konformationsänderung unter nativen Bedingungen durch die Bindung des Phagen an die Bakterienmembran induziert wird. Darüber hinaus stört die Bewegung der langen Schwanzfasern wahrscheinlich ihre Wechselwirkungen mit den kurzen Schwanzfasern und bereitet sie so auf die Bildung der Schwanzdüse vor. Durch die Bindung aller sechs SU10-Langschwanzfasern an Rezeptoren wird der Phagen mit seiner Längsachse senkrecht zur Bakterienmembran positioniert (Abb. 7a, c). Die mutmaßliche Interaktion der Schwanznadel mit der Bakterienmembran löst Konformationsänderungen der Düsenproteine ​​aus, die zur Störung der Interaktion der Düsendomäne vier mit der kurzen Schwanzfaser führen. Durch die Anordnung in einer geraden Linie parallel zur Schwanzachse schaffen die Düsendomänen Platz für die 135°-Drehung der kurzen Schwanzfasern, um vom Phagenkopf wegzuzeigen. Die kurzen Schwanzfasern und Düsenproteine ​​wechseln sich ab und bilden eine 277 Å lange Düse (Abb. 7c). Die Bildung der Düse ermöglicht es den vorhergesagten Rezeptorbindungsdomänen der Kurzschwanzfasern, mit Rezeptoren an der Zelloberfläche zu interagieren. Durch die Bindung der kurzen Schwanzfasern an Rezeptoren kann die aus der Düse herausragende Schwanznadel durch die äußere E. coli-Membran gedrückt werden. Anschließend löst sich die Schwanznadel vom Schwanz, um die Öffnung des Schwanzkanals zu ermöglichen (Abb. 7c). Ejektionsproteine ​​werden wahrscheinlich vor oder zusammen mit dem Beginn des Genoms aus dem SU10-Kopf ausgeworfen. Die Auswurfproteine ​​bilden einen Translokationskanal durch den periplasmatischen Raum und das Auswurfprotein gp20 baut mit Transglycosylaseaktivität das Zellwandpeptidoglycan ab. Das Phagengenom wird über einen Kanal, der durch die Düse und den Translokationskanal gebildet wird, an das E. coli-Zytoplasma abgegeben (Abb. 7c).

Der Phagen SU10 wurde auf dem E. coli-Stamm ECOR10 vermehrt, der bei 37 °C in Nährbrühe (Oxoid) gezüchtet wurde. Phagenlysat aus 300 ml Bakterienkultur wurde mit Turbonuklease (Abnova) (Endkonzentration 5 Einheiten/ml) behandelt, 20 Minuten lang bei 4 °C mit 6000 x g zentrifugiert und durch einen 0,45 μm Polyethersulfon-Spritzenfilter filtriert. Phagen aus dem Filtrat wurden durch 2,5-stündige Zentrifugation bei 54.000 x g und 4 °C in einem 50,2-Ti-Rotor (Beckman Coulter) pelletiert. Phagenpellets wurden durch Inkubation über Nacht in 6 ml eines Phagenpuffers (50 mM Tris-Cl, 10 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 8,0) bei 4 °C gelöst. Aufgelöste Pellets wurden auf einen Stufen-CsCl-Dichtegradienten (3 ml jeder CsCl-Lösung in Phagenpuffer mit Dichten von 1,45 g/ml, 1,50 g/ml und 1,70 g/ml) gelegt und 4 Stunden lang bei 12 °C und 210.000 x g zentrifugiert mit einem SW40Ti-Rotor (Beckman Coulter). Phagenpartikel enthaltende Banden wurden mit einer 0,8-mm-Nadel und einer Spritze gesammelt. Cäsiumchlorid wurde durch Dialyse gegen den Phagenpuffer bei 4 °C über Nacht unter Verwendung eines Visking-Dialyseschlauchs Typ 8/32″, 0,05 mm dick (Teile-Nr. 1780.1, Carl Roth, Deutschland) entfernt.

Die gereinigte Phagenprobe (1012 PFU/ml) wurde mit einer Lösung von 3 M Harnstoff im Phagenpuffer 10-fach verdünnt und 30 Minuten bei 42°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Probe 3x im Phagenpuffer verdünnt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Turbonuclease (Abnova) in einer Endkonzentration von 3,5 Einheiten/ml behandelt. Phagenpartikel wurden durch 1-stündige Zentrifugation bei 75.000 x g und 4 °C in einem 50,2-Ti-Rotor (Beckman Coulter) pelletiert und im Phagenpuffer resuspendiert. Die Proteinzusammensetzung von SU10-Virionen und Zwischenprodukten der Genomfreisetzung wurde mittels SDS-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Analyse verglichen.

Der gereinigte SU10-Phage wurde in Laemmli-Puffer resuspendiert und 3 Minuten lang gekocht, dann wurde die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Turbonuclease in einer Endkonzentration von 2 Einheiten/ml (Abnova) behandelt. Die Proteine ​​wurden durch Tricin-Gradienten-Gelelektrophorese aufgetrennt. Alle wichtigen Proteinbanden wurden aus dem Gel herausgeschnitten und für die massenspektrometrische Analyse verwendet. Die Verarbeitung und Analyse der Massenspektrometriedaten wurde mit der Software FlexAnalysis 3.4 und MS BioTools (Bruker Daltonics) durchgeführt. Mascot-Software (Matrix Science, London, UK) wurde für die Sequenzsuche in exportierten MS/MS-Spektren anhand der Informationsdatenbank des National Centre for Biotechnology und einer lokalen Datenbank mit den erwarteten Proteinsequenzen verwendet. Die Massentoleranz von Peptiden und MS/MS-Fragmenten für die MS/MS-Ionensuche betrug 50 Teile pro Million bzw. 0,5 Da. Für alle Suchen wurden die Oxidation von Methionin und die Propionylamidierung von Cystein als optionale Modifikationen sowie eine Enzymfehlspaltung festgelegt. Berücksichtigt wurden Peptide mit einem statistisch signifikanten Peptid-Score (P < 0,05).

Gereinigte Phagenlösung (4 μl) mit einer Konzentration von 1012 PFU/ml wurde auf ein mit Löchern versehenes, kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (R2/1, Maschenweite 200; Quantifoil) pipettiert, geblottet und durch Eintauchen in flüssiges Ethan mit einem FEI Vitrobot Mark IV vitrifiziert . Die verglaste Probe wurde auf ein Thermo Fisher Scientific Titan Krios-Elektronenmikroskop übertragen, das unter kryogenen Bedingungen und bei einer Beschleunigungsspannung von 300 kV betrieben wurde. Der Strahl wurde für eine parallele Beleuchtung im NanoProbe-Modus ausgerichtet und es wurden komafreie Ausrichtungen durchgeführt, um die verbleibende Strahlneigung zu beseitigen. Mikroaufnahmen von SU10-Virionen wurden mit einer 59.000-fachen Vergrößerung auf einem Falcon III-Direktelektronendetektor im linearen Modus aufgenommen, was zu einer kalibrierten Pixelgröße von 1,38 Å/Pixel führte. Die Bildgebung erfolgte unter Niedrigdosisbedingungen (Gesamtdosis 49 e−/Å2) und Defokussierungswerten im Bereich von –1,2 bis –2,7 μm. Die Belichtung von einer Sekunde wurde in 40 Bilder aufgeteilt und als Film gespeichert. Der Datensatz der Genomfreisetzungszwischenprodukte wurde mit einer 105.000-fachen Vergrößerung an einem K2 Summit-Direktelektronendetektor im Zählmodus erfasst, was zu einer kalibrierten Pixelgröße von 1,34 Å/Pixel führte. Die Bildgebung erfolgte unter Niedrigdosisbedingungen (Gesamtdosis 52 e−/Å2) und Defokussierungswerten im Bereich von –1,2 bis –2,7 μm. Die Belichtung von acht Sekunden wurde in 40 Bilder aufgeteilt und als Film gespeichert. Automatisierte Datenerfassungen wurden mit der Software EPU (Falcon III-Detektor) oder Serial EM (K2 Summit-Detektor) durchgeführt. Die Filme wurden mit der Software MotionCor247 global und lokal (5 × 5 Patches) bewegungskorrigiert und als dosisgewichtete Mikroaufnahmen gespeichert. Die Defokussierungswerte wurden aus ausgerichteten, nicht dosisgewichteten Mikroaufnahmen mit dem Programm Gctf48 geschätzt.

Gitter aus SU10-Virionen, die für die Einzelpartikelerfassung vorbereitet wurden, wurden verwendet, um Tomographie-Neigungsserien aufzuzeichnen, die einen Winkelbereich von –60° bis +60° mit 2°-Schritten abdecken, wobei das bidirektionale Neigungsschema unter Niedrigdosisbedingungen unter Verwendung von SerialEM verwendet wurde. Jede Neigungsreihe wurde mit einem nominellen Defokuswert von –6 µm erfasst. Jedes Bild wurde als Film aus 7 Bildern mit einem Falcon II-Detektor aufgenommen, der im Zählmodus mit einer Dosis von 1 e− /Å2 pro Neigung betrieben wurde. Die kumulative Gesamtdosis für jede Neigungsserie betrug 57 e− /Å2. Die kalibrierte Pixelgröße betrug 1,8 Å. Tomogramme wurden mit eTomo aus dem Paket IMOD49 rekonstruiert. Subtomogramme der Köpfe von SU10-Virionen wurden mit dem Programm PEET50,51 aus dem Paket IMOD mit angewandter D5-Symmetrie gemittelt.

CrYOLO aus dem Softwarepaket SPHIRE Neural Network wurde anhand einer Teilmenge von Bildern von Köpfen von SU10-Virionen trainiert, die manuell ausgewählt wurden52. Die abschließende automatische Auswahl erfolgte anhand von 4 x gruppierten mikroskopischen Aufnahmen mit crYOLO. Die resultierenden Partikelkoordinaten wurden um den Binning-Faktor korrigiert und Bilder von Partikeln (Boxgröße 1296 × 1296 Pixel) wurden mit Relion53 aus den 9.000 ursprünglichen, nicht klassifizierten Mikroaufnahmen extrahiert. Die Partikel wurden mithilfe des im Softwarepaket Xmipp54 implementierten reziproken Space Binning auf 256 px (6,99 Å/Pixel) gruppiert. In Relion wurden mehrere Runden der 2D-Klassifizierung durchgeführt, um intakte Virionen aus dem automatisch ausgewählten Partikelsatz auszuwählen. Das ursprüngliche Modell des SU10-Kopfes aus der Subtomogramm-Mittelung wurde auf eine Auflösung von 30 Å tiefpassgefiltert. Mit Relion 3.1 wurden mehrere Runden der 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung mit auferlegter C5-Symmetrie durchgeführt. Mit dem Softwarepaket Spider55 wurde eine zylindrische Maske vorbereitet, die das Phagengenom ausschließt, um zu verhindern, dass das Signal vom Genom die Kapsidrekonstruktion stört. Nach der anfänglichen automatischen Verfeinerung mit auferlegter C5-Symmetrie wurde die 3D-Klassifizierung ohne den Ausrichtungsschritt durchgeführt. Partikel der besten Klasse wurden für die weitere automatische Relion-Verfeinerung mit auferlegter C5-Symmetrie und maximal zulässigen Abweichungen von vorherigen Ausrichtungen von 10° ausgewählt. Mit zunehmender Auflösung der Rekonstruktion wurden die Partikel nach und nach auf 512 px (3,49 Å/Pixel) und 1296 px (1,38 Å/Pixel) entbündelt. Die endgültige C5-symmetrische Rekonstruktion wurde während der Nachbearbeitung in Relion 3.1 schwellenwertmaskiert, durch die Modulationsübertragungsfunktion dividiert und der B-Faktor geschärft. Um die Auflösung des Kapsids weiter zu verbessern, haben wir das Kapsid in die symmetrische C5-Kappe ohne Schwanz, den symmetrischen D10-Mittelteil und die symmetrische C5-Kappe mit Schwanz unterteilt. Alle diese Teile wurden erneut in kleinere Kästchen extrahiert und ihre Rekonstruktionen wurden mithilfe lokaler Winkelsuchen verfeinert. Um eine asymmetrische Rekonstruktion des Phagenschwanzes und des umgebenden Kapsids zu erhalten, wurde eine Symmetrierelaxation von C5 nach C1 mit dem Programm relion_relax_symm durchgeführt (ergänzende Abbildung 11).

Partikelorientierungen aus der C5-Rekonstruktion des Phagenkopfes wurden verwendet, um Subpartikelbilder zu extrahieren, die auf Portalen und Schwänzen von SU10-Virionen zentriert sind. Die Bilder der Unterpartikel wurden mehreren Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen, was die Auswahl homogener Datensätze ermöglichte. Nach der anfänglichen automatischen Verfeinerung mit auferlegter C12-Symmetrie für das Portal und C6- und C3-Symmetrien für das Heck wurden 3D-Klassifizierungen ohne den Ausrichtungsschritt durchgeführt. Partikel, die zu den besten Klassen gehörten, wurden für die weitere automatische Relion-Verfeinerung mit vorgegebenen Symmetrien und maximal zulässigen Abweichungen von vorherigen Ausrichtungen von 10° ausgewählt. Die resultierenden Karten wurden während der Nachbearbeitung in Relion schwellenwertmaskiert, durch die Modulationsübertragungsfunktion dividiert und der B-Faktor geschärft (ergänzende Abbildung 11).

Partikelorientierungen aus der C6-Rekonstruktion des Phagenschwanzes wurden verwendet, um Subpartikelbilder zu extrahieren, die auf der Schwanznadel des SU10-Virions zentriert waren. Die Bilder der Unterpartikel wurden mehreren Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen, was die Auswahl eines homogenen Datensatzes ermöglichte. Nach der anfänglichen automatischen Verfeinerung mit der auf C3 eingestellten Relax-Symmetrie wurde die 3D-Klassifizierung ohne den Ausrichtungsschritt durchgeführt. Partikel der besten Klasse wurden für die weitere automatische Relion-Verfeinerung mit auferlegter C3-Symmetrie und maximal zulässigen Abweichungen von vorherigen Ausrichtungen von 10° ausgewählt (ergänzende Abbildung 11).

Um eine asymmetrische Rekonstruktion des gesamten SU10-Virions zu erhalten, wurden die Ausrichtungen der C5-symmetrischen Kopfrekonstruktion mit relion_relax_symm gelockert. Mit dem Softwarepaket Spider55 wurde eine kugelförmige Maske hergestellt, die den Phagenschwanz und 40 nm des Kapsids bedeckt.

Die anfängliche Rekonstruktion wurde an Partikelbildern durchgeführt, die auf 256 px (6,99 Å/Pixel) gruppiert wurden, wobei ein hoher Regularisierungsfaktor verwendet wurde und nur Rotationssuchen möglich waren. Die erfolgreiche Entspannung der Symmetrie wurde durch das Vorhandensein biologisch relevanter Merkmale in den Teilen der Rekonstruktion bestätigt, die sowohl zum Kopf als auch zum Schwanz des Phagen gehören. Anschließend wurden die Rekonstruktionen mit auf 512 px (3,49 Å/Pixel) und 1296 px (1,38 Å/Pixel) gruppierten Daten fortgesetzt (ergänzende Abbildung 11).

SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukte wurden manuell mit e2boxer aus dem Softwarepaket EMAN256 verpackt. Die resultierenden Partikelkoordinaten wurden verwendet, um mithilfe von Relion53,54 Partikel aus den 5688 Mikroaufnahmen zu extrahieren. Die Partikel wurden mithilfe des im Softwarepaket Xmipp54 implementierten reziproken Space Binning auf 256 px (6,99 Å/Pixel) gruppiert. Es wurden mehrere Runden der 2D-Klassifizierung in Relion durchgeführt, um intakte Genomfreisetzungszwischenprodukte aus dem Partikelsatz auszuwählen. Die Rekonstruktion des Kapsids des SU10-Virions, tiefpassgefiltert mit einer Auflösung von 30 Å, wurde als Ausgangsmodell für die 3D-Rekonstruktion in Relion verwendet. Mit Relion 3.1 wurden mehrere Runden der 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung mit auferlegter C5-Symmetrie durchgeführt. Die resultierende Karte wurde schwellenwertmaskiert, durch die Modulationsübertragungsfunktion dividiert und während der Nachbearbeitung in Relion um den B-Faktor geschärft (ergänzende Abbildung 12).

Partikelorientierungen aus der C5-Rekonstruktion des Kapsids des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts wurden verwendet, um auf Schwänzen zentrierte Subpartikelbilder zu extrahieren. Die Bilder der Unterpartikel wurden mehreren Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen, was die Auswahl eines homogenen Datensatzes ermöglichte. Nach der anfänglichen automatischen Verfeinerung mit auferlegter C6-Symmetrie wurde die 3D-Klassifizierung ohne den Ausrichtungsschritt durchgeführt. Partikel der besten Klasse wurden für die weitere Relion-Autoverfeinerung mit auferlegter C6-Symmetrie und maximal zulässigen Abweichungen von vorherigen Ausrichtungen von 10° ausgewählt. Die resultierende Karte wurde schwellenwertmaskiert, durch die Modulationsübertragungsfunktion dividiert und während der Nachbearbeitung in Relion um den B-Faktor geschärft (ergänzende Abbildung 12).

Partikelorientierungen aus der C5-Rekonstruktion des Kapsids des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts wurden verwendet, um Subpartikelbilder zu extrahieren, die auf Kapsidoberseiten zentriert sind. Die Bilder der Unterpartikel wurden mehreren Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen, was die Auswahl eines homogenen Datensatzes ermöglichte. Die Partikel wurden C5-symmetrieerweitert und die 3D-Klassifizierung in zehn Klassen wurde ohne den Ausrichtungsschritt durchgeführt. Es wurden Partikel ausgewählt, die zu den besten Klassen gehörten, und Partikelduplikate aus der Symmetrieerweiterung wurden entfernt. Die resultierenden Partikel wurden für die weitere Relion-Autoverfeinerung ohne Symmetrie und mit maximal zulässigen Abweichungen von vorherigen Ausrichtungen von 10 ° verwendet (ergänzende Abbildung 12).

PDB-Strukturen wurden mit dem Programm COOT47 (Portalprotein, Adapterprotein, Reste 1–90 der Langschwanzfaser und proximale Domäne der Kurzschwanzfaser) erstellt, automatisch mit Deep Tracer57 (Düsenprotein) erstellt oder mit Alphafold234 (Zentral- und Rezeptor) modelliert -Bindungsdomänen der kurzen Schwanzfaser und der Schwanznadel). Die Strukturen wurden iterativ im realen Raum mit dem Programm PHENIX real_space_refine.py58 verfeinert und manuell in COOT47 und ISOLDE59 korrigiert. Die Qualität der Strukturen und ihre Passung zu den Kryo-EM-Dichtekarten wurde mittels umfassender Validierung im Programm PHENIX bewertet. FSC-Kurven von Kryo-EM-Rekonstruktionen sind in der ergänzenden Abbildung 13 dargestellt. Ein Modell zur Abbildung von FSC-Kurven einzelner Strukturen und Beispiele für die Anpassung von PDB-Modellen an Kryo-EM-Dichten sind in der ergänzenden Abbildung 14 dargestellt.

Strukturen von SU10-Proteinen, die in Kryo-EM-Rekonstruktionen nicht mit ausreichender Auflösung aufgelöst wurden, um eine Strukturbestimmung zu ermöglichen, wurden mithilfe einer lokalen Installation von AlphaFold Multimer 2.1.2 vorhergesagt. Die Software wurde von https://github.com/deepmind/alphafold unter Verwendung einer Docker-Umgebung installiert. Für die Vorhersage wurden von AlphaFold-Autoren zum Zeitpunkt der Installation (Winter 2021) empfohlene Datenbanken verwendet (BFD, MGnify, PDB70, PDB, PDB seqres, Uniclust30, UniProt, UniRef90)34.

Die zusammengesetzte Karte des SU10-Virions wurde durch die Kombination von Segmenten aus Subpartikelrekonstruktionen von SU10-Virionregionen erstellt. Subpartikel-Rekonstruktionen von Regionen des SU10-Virions wurden mithilfe von Chimera60,61,62 (dem Befehl „In Karte anpassen“) in die asymmetrische Rekonstruktion des gesamten SU10-Virions eingepasst. Die zusammengesetzte Karte wurde aus den folgenden Rekonstruktionen erstellt: C5-symmetrische Kapsidrekonstruktion; Portal aus C12-symmetrischer Halsrekonstruktion; Adapter, lange Schwanzfasern, Düse und kurze Schwanzfasern aus der C6-symmetrischen Schwanzrekonstruktion; und C3-symmetrische Schwanznadelrekonstruktion. Segmente von Subpartikel-Rekonstruktionen wurden mit dem folgenden Verfahren zu der zusammengesetzten Karte kombiniert: (1) Masken, die PDB-Strukturen der Komponentenproteine ​​abdecken, wurden mit pdb2mrc generiert. (2) Die Masken wurden um sechs Voxel und zusätzlich vier Voxel Soft Edge (Relion3 - relion_mask_create) erweitert. (3) Die Subpartikel-Rekonstruktionen wurden mit den entsprechenden Masken (Relion3 – relion_image_handler) multipliziert. (4) Für jeden Segmentschwellenwert wurde die Struktur der gesamten Komponente mit maximal aufgelösten Details zur Anzeige ausgewählt. Für eine Kurzschwanzfaserkarte mit abnehmender Auflösung entlang der Faser wurden drei Segmente mit unterschiedlichen Schwellenwerten ausgewählt. (5) Die Karten der Segmente wurden mit der CCP4-Kartenmaske normalisiert. (6) Die normalisierten Segmente wurden mit dem Chimera-Befehl vop add onGrid zur endgültigen zusammengesetzten Karte kombiniert. Die zusammengesetzte Karte des SU10-Genomfreisetzungszwischenprodukts wurde mit dem gleichen Verfahren aus einem mit C5-Symmetrie rekonstruierten Kapsid und einem mit C6-Symmetrie rekonstruierten Schwanz erstellt.

Eine exponentiell wachsende Kultur von E. coli ECOR10 (OD = 0,3) wurde mit dem Bakteriophagen SU10 (MOI = 10) infiziert, der mit DmaO (BIOTIUM) in Gegenwart von 0,002 M CaCl2 vorgefärbt wurde. Die Infektion wurde in einem PS 75/25 mm Cellview-Zellkulturobjektträger mit Glasboden (Greiner Bio-One) bei 37 °C unter Schütteln mit 100 U/min durchgeführt und 5, 25, 45 und 65 Minuten lang fortgesetzt. Bakterienmembranen und DNA wurden mit SynaptoRed (BIOTIUM) (Endkonzentration 4 μM) und DAPI (Roche) (Endkonzentration 300 nM) gefärbt. Zur Bildgebung wurden die Proben mit einer Mischung aus Glutaraldehyd und Formaldehyd (0,125 % bzw. 4 %) in einem 50 mM Phosphatpuffer (pH=7,5) fixiert. Um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern, wurden die Proben mit 1 % niedrig schmelzender Agarose im Phagenpuffer überschichtet.

Die Proben wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 880-Mikroskop mit Airyscan im RS-Modus mit Fluorophor-Anregung bei den folgenden Wellenlängen abgebildet: DAPI bei 405 nm, DmaO bei 488 nm und SynaptoRed bei 514 nm. Die Daten wurden mit ZEN Black verarbeitet und mit Fiji63 visualisiert.

Eine exponentiell wachsende Kultur von E. coli ECOR10 (OD = 0,3) wurde mit dem Bakteriophagen SU10 (MOI = 10) infiziert. Man ließ die Infektion 5, 25, 45 und 65 Minuten lang fortschreiten. 1,5 ml der infizierten Bakterienkultur wurden durch 1-minütige Zentrifugation bei 10.000 x g und 4°C pelletiert. Die Pellets wurden in 15 μl Phagenpuffer resuspendiert und auf Eis aufbewahrt. Für die Elektronenmikroskopie wurden Gold-Marker (10-nm-Kügelchen) auf das löchrige, mit Kohlenstoff beschichtete Kupfergitter (R3,5/1, Maschenweite 200; Quantifoil) aufgetragen, mit Filterpapier angesaugt und sofort mit 4 μl Zellsuspension bedeckt. Anschließend wurden die Gitter abgetupft und durch Eintauchen in flüssiges Ethan mit einem Vitrobot Mark IV verglast. Tomographische Neigungsserien, die einen Winkelbereich von –60° bis +60° mit 3°-Schritten abdecken, wurden automatisch unter Verwendung eines dosissymmetrischen Neigungsschemas unter Niedrigdosisbedingungen an einem K2 Summit-Direktelektronendetektor aufgezeichnet, der hinter dem Energiefilter im Titan positioniert war Krios-Mikroskop. Jede Neigungsserie wurde mit einem nominellen Defokuswert von –6 µm erfasst und als Film mit 5 Bildern im Zählmodus des Detektors unter Verwendung einer Dosis von 2 e− /Å2 pro Neigung aufgenommen. Die kumulative Gesamtdosis für jede Neigungsserie betrug 57 e− /Å2. Die kalibrierte Pixelgröße betrug 4,33 Å. Tomogramme wurden mit IMOD aus dem Softwarepaket eTomo58 rekonstruiert und visualisiert. Membranen und Flagellen wurden mit dem Programm Amira64 segmentiert. Die Positionen von Phagenpartikeln, Ribosomen (EMD-13270) und dem Chemorezeptor-Array (EMD-10160) wurden mithilfe des in EMclarity64,65 implementierten Template-Matchings identifiziert und die entsprechenden hochauflösenden Strukturen mithilfe interner Skripte im Tomogramm positioniert https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Kryo-EM-Rekonstruktionen und die entsprechenden PDB-Strukturen wurden unter den folgenden EMDB- und PDB-Codes hinterlegt: Strukturen des SU10-Virions: Kapsid mit fünffacher Symmetrie EMD-14488 und PDB-7Z49, asymmetrische Kapsidrekonstruktion EMD-14492 und PDB-7Z4B, Kapsidoberseite EMD -14485 und PDB-7Z46, Kapsidzentrum EMD-14484 und PDB-7Z45, Kapsidboden EMD-14487 und PDB-7Z48, asymmetrische Rekonstruktion von Kapsidboden und Schwanz EMD-14489 und PDB-7Z4A, Hals mit zwölfzähliger Symmetrie EMD-14483 und PDB-7Z44, Schwanz mit sechszähliger Symmetrie EMD-14486 und PDB-7Z47, Schwanznadel mit dreizähliger Symmetrie EMD-14909 und zusammengesetzte Karte des gesamten Virions EMD-14977. Strukturen des Genomfreisetzungszwischenprodukts: Kapsid mit fünffacher Symmetrie EMD-14490, Schwanz mit sechsfacher Symmetrie EMD-14495 und PDB-7Z4F, Kapsidoberseite EMD-14491 und zusammengesetzte Karte des gesamten Genomfreisetzungszwischenprodukts EMD-14920.

Skripte zur Positionierung hochauflösender Strukturen in den Tomogrammen sind unter https://github.com/fuzikt/tomostarpy verfügbar.

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Wir danken CEITEC MU Cryo-Electron Microscopy and Tomography Core Facility und Proteomics Core Facility von CIISB, Instruct-CZ Center, unterstützt von MEYS CR (LM2018127), für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der hier präsentierten wissenschaftlichen Daten. Wir danken der Kerneinrichtung CELLIM, die vom großen RI-Projekt Czech-BioImaging (LM2018129 finanziert von MEYS CR) unterstützt wird, für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der in diesem Dokument vorgestellten wissenschaftlichen Daten. Wir freuen uns sehr über den Zugang zu Rechen- und Speichereinrichtungen im Besitz von Parteien und Projekten, die zum National Grid Infrastructure MetaCentrum beitragen und im Rahmen des Programms „Projekte großer Infrastruktur für Forschung, Entwicklung und Innovationen“ (LM2010005) bereitgestellt werden. Diese Studie wurde vom IT4Innovations Center of Excellence (Projekt CZ.1.05/1.1.00/02.0070) unterstützt. Diese Arbeit, einschließlich der Bemühungen von Pavel Plevka, wurde vom tschechischen Ministerium für Bildung, Jugend und Sport ERC-CZ Consolidator Grant LL1906, dem Czech Science Foundation Grant GA18-17810S und dem Projekt National Institute of Virology and Bacteriology (Programm EXCELES, ID Projekt Nr. LX22NPO5103) – Gefördert von der Europäischen Union – Next Generation EU. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung und -interpretation oder der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Mitteleuropäisches Technologieinstitut, Kamenice 753/5, 625 00, Brünn, Tschechische Republik

Marta Šiborová, Tibor Füzik, Michaela Procházková, Jiří Nováček und Pavel Plevka

Fakultät für Naturwissenschaften, Masaryk-Universität, Kamenice 753/5, 625 00, Brünn, Tschechische Republik

Martin Benešík

Abteilung für Molekulare Biowissenschaften, Wenner-Gren-Institut, Universität Stockholm, 106 91, Stockholm, Schweden

Anders S. Nilsson

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Konzeptualisierung PP; Methodik M.Š, TF, MP, JN und MB; Validierung M.Š. und TF; formale Analyse M.Š., MP, JN und MB; Untersuchung M.Š., MP, JN und MB; Ressourcen AN; Datenkuration M.Š. und TF; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung M.Š., TF und PP; Schreiben – Rezension und Bearbeitung von M.Š., TF und PP; Visualisierung M.Š. und TF; Aufsicht PP; Finanzierungsakquise PP

Korrespondenz mit Pavel Plevka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Šiborová, M., Füzik, T., Procházková, M. et al. Schwanzproteine ​​des Phagen SU10 reorganisieren sich zur Genomabgabe in die Düse. Nat Commun 13, 5622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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Eingegangen: 31. Januar 2022

Angenommen: 12. September 2022

Veröffentlicht: 24. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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