Komplexin

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 155 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der dynamische Aufbau des synaptisch löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiven Faktor-Attachment-REceptor-Komplexes (SNARE) ist entscheidend für das Verständnis der Membranfusion. Traditionelle Ensemblestudien stellen sich der Herausforderung, den dynamischen Aufbau des Proteinkomplexes zu analysieren. Hier üben wir mithilfe einer optischen Dual-Trap-Pinzette eine geringe Kraft auf einen angebundenen Proteinkomplex aus und untersuchen die Faltungsdynamik des SNARE-Komplexes unter mechanischer Kraft, die durch Complexin-1 (CpxI) reguliert wird. Wir rekonstruieren die Klammer- und Erleichterungsfunktionen von CpxI in vitro und identifizieren verschiedene Zusammenspielmechanismen der CpxI-Fragmentbindung am SNARE-Komplex. Während insbesondere die N-terminale Domäne (NTD) eine dominante Rolle bei der Erleichterungsfunktion spielt, hängt die CTD hauptsächlich mit der Klemmung zusammen. Und die Mischung aus 1-83aa und CTD von CpxI kann das Hemmsignal, das mit der Funktion von CpxI in voller Länge identisch ist, effizient wiederherstellen. Unsere Beobachtung identifiziert die wichtige Chaperonrolle des CpxI-Moleküls beim dynamischen Aufbau des SNARE-Komplexes unter mechanischer Spannung und verdeutlicht die spezifische Funktion jedes Fragments von CpxI-Molekülen im Chaperonprozess.

Der Vesikeltransport ist an einer Vielzahl wichtiger Zellaktivitäten beteiligt, beispielsweise an der Freisetzung von Neurotransmittern, der Hormonsekretion und dem intrazellulären Transport. Eine Fehlfunktion des Vesikeltransports führt zu Organelldefekten und Zellfunktionsstörungen. Es korreliert mit dem Auftreten und der Entwicklung vieler Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes, Infektionen und Immunschwäche. Die Forschungen zum Vesikeltransport wurden mehrfach mit Nobelpreisen gewürdigt. Trotz der Bedeutung ist das Verständnis des komplexen und heiklen intrazellulären Transports noch vorläufig und vorläufig, und viele der feineren Regulierungsmechanismen des Vesikeltransports müssen noch weiter aufgeklärt werden. Unter ihnen sind Nervenzellen am repräsentativsten für den Vesikeltransport, da es in Nervenzellen einen besonderen Vesikeltyp gibt, nämlich synaptische Vesikel, die an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt sind.

Die Freisetzung von Neurotransmittern und die interzelluläre Kommunikation erfordern die Membranfusion, die innerhalb einer Millisekunde stattfindet1. Die Membranfusion wird durch entscheidende Fusionsproteine ​​vorangetrieben, wie beispielsweise die SNARE-Proteine ​​(Synaptic-Solidable N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment REceptor) der molekularen Maschine. Neuron SNARE umfasst drei Arten von Monomerproteinen: Syntaxin, SNAP-25 (Synaptosome-assoziiertes Protein 25 kDa) und VAMP (Vesicle-Associated Membrane Protein)2. SNARE verfügt über eine typische Heptanukleotid-Wiederholungsdomäne (SNARE-Motiv), in der verschiedene SNARE-Monomerproteine ​​einen zentralen Arginin- (R) oder Glutamyl- (Q) Rest an der Ionenschicht beisteuern. Daher werden die SNARE-Monomere in R- bzw. Q-SNARE unterteilt3. VAMP ist R-SNARE und hat ein SNARE-Motiv. Snap-25 und Syntaxin-1 sind beide Q-SNARE mit zwei bzw. einem SNARE-Motiv. In der SNARE-Hypothese4 haben verschiedene Vesikel unterschiedliche „Vesikel-SNARE“ (V-SNARE, nämlich VAMP) und die Zielmitglieder haben das „Ziel-SNARE“ (T-SNARE, Syntaxin und SNAP-25). Nur wenn das richtige V-SNARE und T-SNARE einander erkennen, kann der SNARE-Komplex richtig zusammengesetzt werden, um die Fusion von Vesikeln und Plasmamembranen voranzutreiben.

Mittlerweile sind viele regulatorische Proteine, z. B. N-Ethylmaleimid-Sensitivity-Faktor (NSF), lösliche NSF-Adapterproteine ​​(SNAPs), Complexin (Cpx) und Synaptotagmin-1, an der Regulierung des SNARE-Zippers beteiligt und für die Membranfusion von entscheidender Bedeutung effizient und genau zum richtigen Zeitpunkt in vivo ablaufen4,5. In Abwesenheit von SNAP und NSF verbinden sich die drei SNARE-Monomere zu einem stabilen Vier-Helix-Bündel, dem SNARE-Komplex5,6. Herkömmliche Ensemble-Ansätze sind nicht in der Lage, die dynamische Anordnung von SNARE zu zerlegen, und reichen nicht aus, um die weniger bevölkerten, falsch zusammengesetzten Zustände zu erfassen7,8. Darüber hinaus erfolgt der funktionelle SNARE-Zusammenbau in Gegenwart der Gegenkraft, die von negativ geladenen Membranen ausgeübt wird, was einen großen Einfluss auf die Kinetik und Regulierung des SNARE-Zusammenbaus hat9,10.

Allerdings sind die Funktionen vieler wichtiger Regulatoren auf Einzelmolekülebene noch nicht vollständig verstanden. Optische Einzelmolekülpinzetten können mechanische Kraft ausüben und den Abstand in Echtzeit mit hoher Präzision und geringer Lichtschädigung biologischer Moleküle messen. Obwohl der einzelne neuronale SNARE-Komplex in drei unterschiedlichen Stadien mit N-terminaler Vernetzung vorliegt9, ist immer noch unklar, wie die dynamische SNARE-Anordnung durch viele Proteine, z. B. Complexin, reguliert wird. Als kleines zytosolisches α-helikales Protein11 kann Cpx an den SNARE-Komplex binden und einzigartige Funktionen ausführen12. Wir verwenden optische Einzelmolekülpinzetten, um die Cpx-regulierte SNARE-Anordnung zu untersuchen und die dynamische Konformationsänderung und die kraftabhängigen Zwischenzustände zu analysieren. Wir fanden heraus, dass der SNARE-Komplex durch die Vernetzung in der Nähe der Stelle in der -6-Schicht (durch die Disulfidbindungen zwischen VAMP2 (Q36C) und Syntaxin 1 (L209C)) einen Vierzustandsübergang bei konstantem Fallentrennungsmodus aufrechterhielt und der SNARE-Komplex unterscheidbar war Dynamik in Gegenwart verschiedener Fragmente von CpxI-Molekülen aufgrund der jeweiligen Bindungsstellen aus Einzelmolekülexperimenten. Das Zusammenspiel von CpxI mit einzelnen funktionellen SNARE-Komplexen würde durch optische Dual-Trap-Pinzetten während des dynamischen Übergangs unter mechanischer Spannung identifiziert werden13,14. Eine solche Einzelmolekültechnik ist nicht nur ein ergänzendes Werkzeug zu den Ensemble-Methoden, sondern kann auch viele wichtige und weniger häufig vorkommende Zwischenprodukte erkennen, die an der Proteinfunktion beteiligt sind. Insbesondere im Zusammenspiel von CpxI- und SNARE-Assemblierung deuten unterscheidbare Motive der CpxI-Moleküle auf völlig unterschiedliche Bindungsstellen und Konfigurationen hin, die durch unseren Einzelmolekülansatz aufgedeckt wurden.

Wir haben im Molecular Imaging System der National Facility for Protein Sciences Shanghai eine optische Dual-Trap-Pinzette auf einem Betonhintergrund gebaut und die Differentialerkennung eingesetzt, um das systematische Rauschen aus der Umgebung zu minimieren14,15,16. Das Instrument wurde außerdem von allen Umgebungsgeräuschen isoliert, einschließlich des Lüfters des Lasercontrollers, und alle Vorgänge wurden außerhalb des isolierten Raums durchgeführt, nachdem die Proben in die Mikrofluidik geladen wurden. Die hochauflösenden optischen Doppelfallenpinzetten wurden durch Aufteilen eines 1064-nm-Infrarotlasers (Spectra Physics) mit orthogonaler Polarisation hergestellt (Layout in Abb. 1a). Zwei Mikrokügelchen wurden von der optischen Dual-Trap-Pinzette eingefangen. Eine mit dem Protein-DNA-Komplex beschichtete Mikrosphäre wird stationär gehalten, während die andere mit Streptavidin-Beschichtung beweglich ist, um sich der stationären Mikrosphäre zu nähern und eine Bindung zu bilden (siehe Zusatzfilm zur Demonstration des Fangvorgangs, Hintergrundinformationen 6). Obwohl er beweglich ist, ist der Strahlfleck auf der hinteren Brennebene der Objektive stationär, wobei die Intensitätsverteilung von der Position der eingefangenen Mikrokügelchen abhängt. Sobald die Bindung erkannt wird, trennt sich die bewegliche Falle bis zu einem bestimmten Abstand von der stationären Falle, um Kraft auf die Bindung des mit dem Protein verbundenen DNA-Griffs auszuüben.

a Aufbau einer optischen Dual-Trap-Pinzette. Der Einfangstrahl stammt von einem Festkörperlaser mit einer zentralen Wellenlänge von 1064 nm. ISO, Isolator; HW, Halbwellenplatte; BD, Beam Dump; T, Teleskop; PBS, polarisierender Strahlteiler; OBJ, Wasserimmersionsobjektiv; L, Linsen; TL, Tubuslinse; PSD, Positionsempfindlicher Detektor; LED, Laser emittierende Diode; DM, dichroitischer Spiegel. b Schematische Darstellung des Einzelmolekülaufsatzes. Der vormontierte SNARE-Komplex wurde über eine Disulfidbindung mit einem 2.260-bp-DNA-Griff vernetzt und weiter mit zwei Mikrokügelchen entweder über Digoxigenin/Anti-Digoxigenin oder Biotin/Streptavidin verbunden. c Kraft-Ausdehnungs-Kurven (FECs) eines einzelnen SNARE-Komplexes beim Ziehen (schwarz) und Entspannen (grau). Die kontinuierlichen Bereiche der FECs, die verschiedenen Montagezuständen entsprechen (durch rote Zahlen markiert), wurden mithilfe des Wurmkettenmodells (rote Linien) angepasst. Der Einschub zeigt eine Nahaufnahme des Bereichs zwischen zwei roten Punktmarkierungen. d Verlängerungszeittrajektorien einzelner SNARE-Komplexe bei konstantem Fallenabstand. Die vom Hidden-Markov-Modell (HMM) abgeleiteten idealen Zustandsübergänge werden in roten Linien ausgedrückt. Die Positionen verschiedener Bundesstaaten sind durch grüne gestrichelte Linien markiert und mit den Bundesstaatsnummern gekennzeichnet (Ergänzungsabbildung 1, Ergänzungstabelle 1). Die Daten wurden mit einem Zeitfenster von 0,2 ms gefiltert. SNARE-Konfigurationen entsprechen den Zuständen in Verlängerungszeittrajektorien, schwarze Zahlen und L (−6 L, −2 L, +2 L) geben unterschiedliche Schichten an (−6 Schicht, −2 Schicht, +2 Schicht).

Um den reversiblen und regulatorischen SNARE-Zusammenbau zu beobachten, haben wir SNARE-Komplexe entworfen, die die gesamte zytoplasmatische Domäne und eine Vernetzungsstelle zwischen Syntaxin und VAMP2 (Synaptobrevin-2) in der Nähe der hydrophoben Schicht -6 enthalten (Abb. 2b). Die SNARE-Proteine ​​wurden unabhängig voneinander gereinigt und dann in vitro zu SNARE-Komplexen vorassembliert (ergänzende Abbildung 2). Unser CpxI-SNARE-Bindungsexperiment bestätigte, dass CpxI nicht an SNARE-Monomere bindet, wohl aber an den SNARE-Komplex (ergänzende Abbildung 3). Ein 2.260-bp-DNA-Handle (Hintergrundinformationen 5), das eine aktivierte Thiolgruppe am 5'-Ende enthielt, wurde der Lösung des SNARE-Komplexes in einem Molverhältnis von 1:20 zugesetzt. Intramolekulare und intermolekulare Vernetzungen fanden unter freiem Himmel zwischen den Cysteinresten auf Syntaxin und VAMP2 (intramolekular) sowie zwischen VAMP2 und dem DNA-Griff (intermolekular) statt. Der DNA-Griff enthält zwei Digoxigenin-Einheiten am 3′-Ende. Sowohl die Thiolgruppe als auch die Digoxigenin-Einheiten am Griff wurden in die PCR durch Primer eingeführt. Während des Einzelmolekülexperiments wurde der SNARE-Komplex über den DNA-Griff zwischen Anti-Dig- und Streptavidin-Kügelchen über den Dual-Dig- und Biotin-Tag gebunden (Abb. 1b).

a Verlängerungszeittrajektorien einzelner SNARE-Komplexe bei konstanter Fallentrennung in Gegenwart von CpxI. Der Pfeil zeigt die Verabreichung von 8 μM CpxI-Molekülen voller Länge an. Die vom Hidden-Markov-Modell (HMM) abgeleiteten idealen Zustandsübergänge sind in roten Linien überlagert. Die Positionen verschiedener Bundesstaaten sind durch grüne gestrichelte Linien markiert und mit den Bundesstaatsnummern beschriftet. Die Daten wurden mithilfe eines gleitenden Durchschnittsfilters mit einem Zeitfenster von 0,2 ms gefiltert. b Nahaufnahmen der Region, die in a durch gestrichelte blaue Rechtecke markiert ist. SNARE-Konfigurationen entsprechen den Zuständen, schwarze Zahlen und L (−6 L, +2 L) geben unterschiedliche Schichten an. c Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Erweiterungen entsprechen den Spuren in a in Gegenwart (roter Kreis) und Abwesenheit (schwarzes Dreieck) von CpxI und ihren besten Anpassungen durch eine Summe von vier Gaußschen Funktionen (rote und schwarze Linien). Die offenen Abstände für diese Zustände in Abb. 2c betragen \(0\) nm, \(4,6\pm 2,0\) nm, \(6,9\pm 2,3\) nm bzw. \(14,6\pm 2,0\) nm, in Bezug auf Zustand 2 (d. h. der offene Abstand für Zustand 2 wird mit 0 angenommen). d FECs eines einzelnen SNARE-Komplexes vor (schwarz) und nach (rot) der Zugabe von 8 μM CpxI, und die cyanfarbene Linie ist die entspannende FEC nach der Zugabe. Die FECs der verschiedenen Zyklen überschneiden sich im Allgemeinen, wurden jedoch aus Gründen der Übersichtlichkeit entlang der x-Achse verschoben. Der Einschub zeigt eine Nahaufnahme der Region in einem gestrichelten blauen Rechteck.

Um einen einzelnen SNARE-Komplex zu manipulieren, haben wir den Komplex entweder gezogen oder entspannt, indem wir eine optische Falle mit einer konstanten Geschwindigkeit (typischerweise 20 nm/s) relativ zur anderen bewegt haben, oder den Komplex unter konstantem Fallenabstand gehalten. Sowohl die Kraft als auch die Ausdehnung des Protein-DNA-Komplexes wurden bei 10 kHz aufgezeichnet. Wir hatten versucht, das SNARE an vier Stellen zu vernetzen (Schicht −1, −2, −3, −6, ergänzende Abbildung 4, ergänzende Abbildung 5, Hintergrundinformationen 8), jedoch nur die Vernetzung an zwei davon (−2, und −6 Schichten) waren im anschließenden Einzelmolekülexperiment erfolgreich, da die Wahrscheinlichkeit, eine wirksame Bindung zu bilden, für die Konstrukte, die entweder auf −1 oder −3 Schichten vernetzt waren, sehr gering war. Damit das CpxI ausreichend mit längeren NTD-Fragmenten in SNARE interagieren kann, gehen die meisten Daten von einer Vernetzung auf der −6-Schicht aus, sodass der Interaktionsbereich auf dem SNARE-Komplex maximal ist. Wenn die Kraft auf 7–13 pN ansteigt, beobachten wir einen langsamen Sprung von ca. 3 nm (zwischen den Zuständen 1 und 2 in Abb. 1c), der der Öffnung der Linkerdomäne des SNARE-Komplexes entspricht9,13. Wenn die Linkerdomäne zerlegt wird, geht das SNARE vom Zustand 1 mit vollständig geschlossenem/gefaltetem Zustand in den Zustand 2 mit offenem Linker über. Wenn die Kraft jedoch auf 17–19 pN9 ansteigt, springt der SNARE-Komplex zwischen vier Zuständen (Zustand 2–5) mit einem maximalen Ausdehnungsunterschied von ~15 nm (Abb. 1c), was mit der Vernetzung in der −6-Schicht übereinstimmt9,13 ,18. Daher erfolgt die vollständige Dissoziation des SNARE-Komplexes an der mittleren Domäne (MD, Zustand 3-4) und am N-Terminal (Zustand 4-5) nicht unmittelbar nach dem Zusammenbau des SNARE-Komplexes am C-Terminus (Zustand 2). -3), da am N-Terminus der −6-Schicht eine Keimbildungsstelle für die NTD-Zipperbildung vorhanden ist13. Der Übergang zwischen den Zuständen 2–5 unterscheidet sich also vom Hopping+Rip-Signal des SNARE-Komplexes mit −7-Schicht-Vernetzung (oder als N-terminale Vernetzung bezeichnet)9. In diesem Fall wird die langsame Dissoziation des Vier-Helix-Bündels des SNARE-Komplexes durch das kontinuierliche Springen (zwischen Zustand 2 und 5 in Abb. 1c) dargestellt. Beachten Sie, dass es in der Nähe der zentralen Ionenschicht (0-Schicht) zu einer Dissoziation der mittleren Domäne (MD) des SNARE-Komplexes (Zustände 3–4) kommt. Wenn die Kraft weiter zunimmt, entsteht ein Riss für den SNAP25-Tropfen, der nicht durch eine Disulfidbindung verbunden ist. Wenn die Kraft allmählich unter 5 pN absinkt, konnte der SNARE-Komplex aufgrund des Fehlens von SNAP25 nicht zur vollständigen Anordnung zurückkehren (Abb. 1c, graue Kurve). Die Kraft-Ausdehnungs-Kurve der Griff-DNA würde mithilfe des Worm-like-Chain-Modells19 angepasst werden (gestrichelte Kurve in Abb. 1c). Abb. 1d zeigt eine typische Verlängerungszeitkurve, wenn die Fallentrennung mit einer angelegten durchschnittlichen Kraft von ~19 pN fixiert bleibt. Der SNARE-Komplex würde im Gleichgewicht zwischen 4 Zuständen wechseln (Zustand 2-5, Abb. 1d), die den vier verschiedenen Konformationen des SNARE-Komplexes entsprechen: Linkerdomäne öffnet sich (Zustand 2), C-Terminal entfaltet sich zur +2-Schicht (Zustand). 3), MD entfaltet sich zur −1-Schicht (Zustand 4) und der N-Terminus entfaltet sich, bevor SNAP-25 abfällt (Zustand 5).

Um die CpxI-abhängige SNARE-Montage/Demontage zu charakterisieren, haben wir die Verlängerungszeittrajektorien bei einer bestimmten durchschnittlichen Kraft gemessen, bei der SNARE zwischen vier Zuständen wechselt (Abb. 2a). Zunächst wurde der erfasste SNARE-Komplex über einen vollständigen Zyklus gedehnt, um den korrekten Zusammenbau zu überprüfen (siehe Zusatzvideo zum Fangvorgang) und die Gleichgewichtskraft des Zwischenzustands zu bestimmen. Die durchschnittliche Gleichgewichtskraft liegt im Allgemeinen zwischen 18 und 20 pN. Die Gesamtverteilung der Gleichgewichtskräfte verschiedener SNARE-Moleküle nähert sich einer Normalverteilung für alle gemessenen SNARE-Komplexe an. Ein einzelner SNARE-Komplex wurde von einer optischen Dual-Trap-Pinzette mit fester Trap-Trennung gehalten, und 8 μM CpxI wurden in einem separaten Kanal („Proteinkanal“, ergänzende Abbildung 6) zugeführt, um CpxI-Moleküle direkt in die Region zu transportieren, in der die SNARE-Faltung erfolgte /Entfaltung fand statt. Cpx besteht aus vier Domänen: der N-terminalen Domäne (NTD, 1–26 aa), der akzessorischen Helix (AH, 26–48 aa), der zentralen Helix (CH, 48–70 aa) und der C-terminalen Domäne (CTD, 70–48 aa). 134 aa) (Einschub in Abb. 2a). Die Kristallstruktur des Cpx/SNARE-Komplexes und Mutageneseexperimente haben gezeigt, dass das CH direkt mit SNAREs assoziiert ist, was für die Ausführung der Funktion von Cpx unerlässlich ist20,21.

In Gegenwart von 8 μM CpxI voller Länge änderten 49 SNARE-Komplexe ihren Zustand nach Zugabe von CpxI. Bei 45% von ihnen (22 Moleküle) änderte sich die Verteilung der SNARE-Komplexe von 2 bis 5 Zuständen in 3 bis 5 Zustände (Abb. 2a – d, ergänzende Abbildung 7), was bedeutet, dass der reversible Auf- und Abbau auf N beschränkt ist -Terminal und der Übergang des C-Terminals ist nicht zulässig (C-Terminal-blockierter Zustand). Wie in der Zusatzinformation 6 erwähnt, ist die Signalrate definiert als das Verhältnis eines bestimmten Signals zur Summe aller Signale (Hintergrundinformation 12). Darüber hinaus veränderten sich die FEC-Kurven im Vergleich zu denen ohne CpxI stark (Abb. 2d). Die meisten SNARE-Komplexe konnten sich nicht vollständig zusammenziehen, selbst wenn die Kraft unter 5 pN fiel (Abb. 2d, C-terminal geklemmter Zustand, cyanfarbene Linie), was darauf hindeutet, dass CpxI in den C-Terminus von SNARE eingefügt werden könnte und das vollständige Zusammenziehen des SNARE-Komplexes hemmt (Abb. 2a–d). Die HMM-Analyse der Verlängerungszeittrajektorien legt nahe, dass der SNARE-Komplex in Gegenwart von 8 μM CpxI voller Länge (1–134 aa) an den C-terminalen blockierten Zustand gebunden war (Abb. 2c, vorher: schwarz, Zustand 2–5; nachher: ​​rot, Zustand 3-5). Dieses Signal entspricht der Klemmfunktion von CpxI: Hemmt den vollständigen Aufbau des SNARE-Komplexes.

Wir beobachteten auch, dass der SNARE-Komplex durch CpxI in den genau halbgeschlossenen Zustand geklemmt werden konnte (mittelgeklemmter Zustand, 7 Moleküle, 14 % Signalrate, Abb. 2a, b, d). Dementsprechend fand die dynamische Faltung des SNARE-Komplexes in dieser Situation nur zwischen 3 und 4 Zuständen statt (ergänzende Abbildung 8a). Wir haben diesen Komplex weiter gedehnt, indem wir die Kraft erhöht haben, und haben herausgefunden, dass eine höhere Kraft erforderlich ist, um diesen Zustand mit halbem Reißverschluss zu durchbrechen. Dies bestätigte, dass CpxI die C-terminale Anordnung von SNARE-Komplexen hemmen und gleichzeitig den N-Terminus stabilisieren kann. Diese Beobachtung bestätigte auch die Ensemblestudien zur Klemmfunktion des CpxI im physiologischen Zustand.

Überraschenderweise kann der SNARE-Komplex auch nach Zugabe von CpxI im C-terminal stabilisierten Zustand bleiben (C-terminal stabilisierter Zustand, 20 Moleküle, 41 % Signalrate, Abb. 2a, b, d). Dementsprechend haben sich SNARE-Komplexe vom Springen zwischen 2–5 Zuständen zu einer Aufrechterhaltung nur im Zustand 2 durch die Zugabe von CpxI verändert (ergänzende Abbildung 8b). Eine weitere Dehnung der Moleküle mit hoher Kraft würde diesen C-terminal stabilisierten Zustand aufbrechen, was auf die Fähigkeit von CpxI hinweist, das Vier-Helix-Bündel von SNARE-Komplexen zu stabilisieren.

Darüber hinaus ist im Prozess aufeinanderfolgender Runden beim Ziehen und Entspannen desselben SNARE-Komplexes die Wahrscheinlichkeit, dass nach einem bestimmten Signal im nachfolgenden Zyklus dasselbe Signal auftritt, höher als 80 %, was darauf hindeutet, dass sich derselbe CpxI mit demselben SNARE-Komplex in mehreren kombiniert Zyklen des Ziehens und Entspannens (Abb. 2d). Dies bestätigt, dass die Bindung des Cplx an den SNARE-Komplex viel stärker ist als die Entfaltung des SNARE-Komplexes.

Um die spezifische Funktion mehrerer Domänen in der CpxI-abhängigen SNARE-Übergangsdynamik herauszufinden, haben wir verschiedene Verkürzungen von CpxI in den einzelnen SNARE-Übergangskomplex eingeführt, einschließlich 1–83 aa, 26–83 aa, 48–73 aa, Mischung aus 1 -83 aa und 83-134 aa (Abb. 3a). Bemerkenswerterweise fanden wir heraus, dass die Signale der SNARE-Faltung in Gegenwart von 1–83 aa (ohne die CTD von CpxI im Vergleich zu CpxI voller Länge) unter allen Arten von CpxI-Fragmenten am konsistentesten waren. In Gegenwart von 8 μM 1-83 aa CpxI änderten 49 dynamische SNARE-Komplexmoleküle ihren Zustand nach der Zugabe von CpxI, während weitere 13 Moleküle nach der Zugabe keine Veränderung zeigten. Interessanterweise deuten 94 % (46 Moleküle) der Verlängerungszeitspuren dieser 49 SNARE-Komplexe mit signifikanter Konfigurationsänderung darauf hin, dass der SNARE-Komplex im C-terminalen stabilisierten Zustand stabilisiert war und eine höhere Kraft erforderlich war, um das CpxI-Molekül weiter zu dissoziieren ( Abb. 3b). Und andere 3 SNARE-Komplexe (6 %) waren auf den N-terminalen Übergang beschränkt. Offensichtlich stabilisiert die 1-83-aa-Domäne von CpxI das SNARE im C-terminal stabilisierten Zustand. Mit anderen Worten, 1-83 aa kann nur die Erleichterungsfunktion implementieren.

a Schematische Darstellung der in den Experimenten verwendeten Domänenfragmente des CpxI. b Verlängerungszeittrajektorien einzelner SNARE-Komplexe bei konstanter Fallentrennung, die die SNARE-Entfaltungskinetik vor und nach der Zugabe von 8 μM Fragment 1-83aa von CpxI in Gegenwart einer durchschnittlichen Kraft von (i) 17,5 pN und (ii) 19 pN zeigen . c Die Verteilung der Entfaltungskraft von SNARE-Komplexen mit (orange) oder ohne (blau) 1–83 AA-Fragmenten. Das Hüpfen findet in Abwesenheit von CpxI bei ~21 pN statt, während die durchschnittliche Kraft auf ~24 pN ansteigt und einige Ereignisse bei einer noch höheren Kraft von ~43 pN stattfinden. d Kraft-Ausdehnungs-Kurven (FECs) eines einzelnen SNARE-Komplexes vor (schwarz) und nach (rot) der Zugabe von 8 μM 1-83 aa. Die 1-83 aa-Domäne von CpxI stabilisiert die SNARE-Anordnung im C-terminal stabilisierten Zustand, wobei sich 59 % der FECs leicht veränderten, mit einem Anstieg von bis zu 5 pN (#1) auf die entpackte Kraft des SNARE-C-Terminus und 34 % der Kraft-Ausdehnungs-Kurve (FEC) veränderten sich dramatisch mit einem Anstieg von mehr als 5 pN (#2) auf die entpackte Kraft des SNARE-C-Terminus.

Die Exozytose von Neurotransmittern und Hormonen ist ein streng kontrollierter Prozess, der sich entwickelt hat, um zeitliche Präzision und Geschwindigkeit der interzellulären Kommunikation zu gewährleisten. Cpx ist wahrscheinlich das am kontroversesten diskutierte SNARE-interagierende Protein, das an der Exozytose beteiligt ist. Die Untersuchung des Regulierungsmechanismus des SNARE-Komplexes hat eine wichtige Bedeutung für die Vervollständigung der Vesikelfusionstheorie und leitet die klinische Behandlung der damit verbundenen Krankheiten. Die Exozytose könnte durch die Interaktion mehrerer Domänen mit dem SNARE-Komplex ausgelöst werden. Um die Wirkung von CpxI auf das SNARE-Zippering zu untersuchen, beobachteten wir eine Reihe prominenter Langzeitzustände im Prozess des schnellen SNARE-Übergangs nach der Einführung von 8 μM CpxI voller Länge und verschiedener Arten von verkürztem CpxI.

Die Entfaltungskräfte des C-Terminus in SNARE-Komplexen sind normalerweise um durchschnittlich ~ 21 pN verteilt (Abb. 3c, erste blaue gestrichelte Linie, ergänzende Abbildung 9). In Gegenwart von CpxI nahmen die Entfaltungskräfte des C-Terminus in SNARE-Komplexen jedoch unterschiedlich zu. Bei diesen C-terminal stabilisierten Signalen erhöhte sich die Öffnungskraft des C-Terminals für 34 % der untersuchten SNARE-Komplexe um mehr als 5 pN, und die Öffnungskraft für 59 % der C-terminalen SNARE-Komplexe stieg auf bis zu 5 pN (Abb. 3c, d).

Die NTD (1–26 aa) ist eine wichtige Domäne von CpxI zur Stabilisierung des C-Terminus des SNARE-Komplexes22,23, insbesondere die Fähigkeit von CpxI, den SNARE-Komplex zu stabilisieren, kann größtenteils von seiner NTD abhängen. Um die NTD-Rolle bei der CpxI-abhängigen SNARE-Disassemblierung zu bestimmen, haben wir die NTD im CpxI-Konstrukt entfernt. In Gegenwart von CpxI 26–83 aa änderten 38 dynamische Moleküle ihren Zustand nach Zugabe von CpxI (Abb. 4a, b). Interessanterweise waren die Verlängerungszeitspuren von 25 Molekülen (66 %) immer noch am C-Terminus stabilisiert (ergänzende Abbildung 10), während der C-terminale Übergang von 12 SNARE-Komplexen blockiert war (31, 5 %, Abb. 4a, b). Was das letztgenannte Signal betrifft, konnten die meisten SNARE-Komplexe auch dann keinen vollständigen Reißverschluss erreichen, wenn die Kraft unter 5 pN fiel (Abb. 4c, cyanfarbene Linie). Die Rate des C-terminal stabilisierten Zustands nahm dramatisch ab, was zeigt, dass die Entfernung von NTD große Veränderungen in der CpxI-abhängigen SNARE-Zerlegung verursachte (Abb. 4d), was darauf hinweist, dass CpxI den SNARE-Komplex abhängig von seiner N-terminalen Domäne entscheidend stabilisiert (NTD, 1-26 aa). Dies liefert einzelne Molekülbeweise zur Unterstützung früherer Berichte darüber, dass sich die NTD-Domäne von CpxI an dem Punkt lokalisiert, an dem der trans-SNARE-Komplex in die Fusionsmembranen eingefügt wird24 oder den C-Terminus des SNARE-Komplexes blockiert, wenn kein Auslösesignal für die Fusion der Mitglieder vorliegt23. 25.

In Gegenwart einer 8 μM AH-CH-Domäne (26–83 aa) änderten 38 von 66 (57,5 %) dynamischen Molekülen ihren Zustand nach der Zugabe des CpxI-Fragments. a Die Trajektorien während der Verlängerung und b die vergrößerte Ansicht der Spuren im gestrichelten Rechteck deuten darauf hin, dass 66 % von ihnen nach der Zugabe von 8 μM AH-CH-Domäne (26–83 aa) in Wirklichkeit in den C-terminal stabilisierten Zustand stabilisiert wurden Nach (rot) der Zugabe von 8 μM AH-CH-Domäne waren 31,5 % des SNARE-Komplexes im C-terminalen blockierten Zustand fixiert. Durch die Hinzufügung eines kürzeren Fragments der CH-Domäne (8 μM 48–73 aa) änderten 26 von 32 (81 %) dynamischen Molekülen ihren Zustand in Gegenwart des CpxI-Fragments. c FEC-Kurve, schwarz: Ziehen vor der Zugabe von CpxI, grau: Entspannen vor der Zugabe von Cpx, rot: Ziehen nach der Zugabe von CpxI, Cyan: Entspannen nach der Zugabe von CpxI. d Zusammenfassung der Verteilung der verschiedenen Arten von Signalen, die durch Fragmente von 1–83 aa oder 26–83 aa eingeführt werden. e FECs einzelner SNARE-Komplexe in Gegenwart lediglich einer CH-Domäne. 96 % des SNARE-Komplexes waren nach (rot) der Hinzufügung der CpxI-CH-Domäne an den C-terminalen blockierten Zustand gebunden. Der gepaarte t-Test wurde angewendet, um die Statistiken mit einem p-Wert von *p < 0,04, **p < 0,002 und ***p < 10-8 auszuwerten.

Es wird angenommen, dass die CH-Domäne (48–73 aa) von Cpx das kleinste Fragment ist, das direkt an den SNARE-Komplex bindet24. Wir haben dem Einzelmolekül-SNARE-Komplex-Experiment eine 8 μM CH-Domäne von CpxI zur Verfügung gestellt und festgestellt, dass das CpxI-CH den Zusammenbau des C-Terminus des SNARE-Komplexes leicht hemmt (Abb. 4a, b). Konkret änderten 26 Moleküle ihren Zustand nach der Zugabe von CpxI und 96 % ihres C-terminalen Übergangs waren leicht blockiert (25 Moleküle, Abb. 4e). Allerdings zeigten diese Moleküle mit abnehmender Kraft eine vollständige Assemblierung (die Cyan-Linie in Abb. 4e), ganz anders als der Effekt anderer längerer CpxI-Fragmente (die Cyan-Linie in Abb. 2f, 4c). Ein viel kürzeres Fragment von CpxI 48–73 aa hemmt die Faltung des SNARE-Komplexes an der CTD nur geringfügig und reicht nicht aus, um den SNARE-Komplex stark in den C-terminal blockierten Zustand zu klemmen.

Zwischen einzelnen CH (48–70 aa) und dem SNARE-Komplex trat eine schwache Wechselwirkung auf, da die richtige und funktionale Ausrichtung die Zusammenarbeit anderer Domänen in CpxI erfordert. Die Kristallstrukturen des Cpx:SNARE-Komplexes zeigen unterschiedliche Wechselwirkungsflächen für Cpx unterschiedlicher Länge. Für Cpx 32–72 aa26 oder 24–73 aa26 bindet das Cpx CH (48–70 aa) an den SNARE-Komplex in der mittleren Domäne bei etwa 0 ~ +1 Schicht; Bei einem kürzeren Cpx 49–76 aa (der fast nur CH enthält)21 bindet das Cpx CH an den proximalen C-Terminus des SNARE-Komplexes. Wenn das Cpx-Peptid zu klein ist, verschiebt sich die Bindungsposition von CH in Richtung des C-Terminus des SNARE-Komplexes. Dies deutet darauf hin, dass bei einem zu kurzen Cpx-Fragment (nur CH) wahrscheinlich schwache oder sogar fehlerhafte Wechselwirkungen auftreten, da die funktionelle Bindung von Cpx die Koordination anderer Cpx-Domänen erfordert. Unser Experiment mit optischen Einzelmolekülpinzetten hat bestätigt, dass die Region mit 26–83 aa in CpxI die „minimale Klemmdomäne“ des Proteins ist27,28. Insbesondere ist CpxI zur Stabilisierung des SNARE-Komplexes entscheidend auf seine NTD (1–26 aa) angewiesen.

Aktuelle Funktionsanalysen mit C. elegans Cpx ergaben, dass die hemmende Wirkung von CpxI wichtig, aber nicht ausreichend für die Membranbindung ist29,30, was die Wechselwirkungen des Cpx-C-Terminus zur Hemmung der Vesikelfusion rätselhaft macht. Hiermit klären wir, ob CTD in Abwesenheit von Phospholipid funktionsfähig ist. CpxI CTD kann in Abwesenheit von CH nicht direkt an SNARE binden, und das CTD-Fragment (83–134 aa) bindet nicht an 1–83 aa (ergänzende Abbildung 11). Wir führen das CTD-Fragment (83–134 aa) in Kombination mit 8 μM 1–83 aa CpxI ein, um während der dynamischen Montage mit dem SNARE-Komplex zu interagieren. Dieses Schema ähnelt der Zugabe von CpxI voller Länge, jedoch wird jedes CpxI-Molekül in zwei Teile getrennt. Unerwarteterweise änderten 18 SNARE-Komplexmoleküle ihren Zustand nach der Zugabe von 8 μM 1-83 aa-Fragment und 8 μM 83-134 aa (mit einem Molverhältnis von 1:1); 21 SNARE-Komplexmoleküle änderten ihren Zustand nach Zugabe von 8 μM 1-83 aa und 16 μM 83-134 aa (molares Verhältnis 1:2); 22 SNARE-Komplexmoleküle änderten ihren Zustand nach Zugabe von 8 μM 1-83 aa und 24 μM 83-134 aa (Molverhältnis 1:3) (Abb. 5a – c, ergänzende Abbildung 12). Unterschiedliche Kombinationen von CpxI-Fragmenten führen zu unterschiedlichen Arten der Signalverteilung (Abb. 5c).

a Verlängerungszeittrajektorien einzelner SNARE-Komplexe zeigen die SNARE-Entfaltungskinetik vor und nach der Zugabe von 8 μM-Fragmenten von 1–83 aa und 8/16/24 μM-Fragmenten von 83–134 aa in Echtzeit. b Charakteristische Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen der Erweiterungen, die den Spuren in A entsprechen, und ihre besten Anpassungen an eine Summe von vier Gaußschen Funktionen (rote Linien). c Die Verteilung verschiedener Arten von Signalen, die durch Fragment 1-83 aa von Cpx, Cpx voller Länge und eine Mischung aus 1-83 aa und 83-134 aa mit verschiedenen Verhältnissen eingeführt werden. Mit zunehmender CTD-Konzentration nimmt der Anteil des C-terminal blockierten Zustands und des mittelgeklemmten Zustands zu, während der Anteil des C-terminal stabilisierten Zustands abnimmt. Wenn das Verhältnis 1:3 erreicht, sind die Signaltypen und der Signalanteil identisch mit denen für CpxI voller Länge. Der gepaarte t-Test wurde angewendet, um die Statistiken mit einem p-Wert von *p < 0,04, **p < 0,002 und ***p < 10-8 auszuwerten.

Interessanterweise nimmt der Anteil des C-terminal blockierten Zustands und des mittelgeklemmten Zustands mit zunehmender Konzentration des CpxI-CTD-Fragments zu, während der Anteil des C-terminal stabilisierten Zustands abnimmt (Abb. 5c). Mittlerweile steigt auch die Wahrscheinlichkeit des C-terminal blockierten Zustands und des mittelgeklemmten Zustands (Klammer) mit der Konzentration. Bemerkenswerterweise wurden mehr SNARE-Komplexe im mittleren Zustand festgeklemmt: Sie können nicht wieder zu einem vollständig zusammengebauten Komplex zusammengebaut werden und erfordern eine höhere Kraft, um den halb geschlossenen Zustand aufzubrechen. Darüber hinaus kann die Klemmfunktion von Cpx durch Fragment 1-83 aa von CpxI und dessen CTD als separate Fragmente in vitro wiederhergestellt werden (Abb. 5c, letzte beiden Spalten). Daher ist keine physische Kontinuität über die gesamte Länge von CpxI erforderlich, um die Klemmfunktion einzurichten. CTD von CpxI hemmt den vollständigen Reißverschluss des SNARE-Komplexes und spielt eine wichtige Rolle bei der Klemmfunktion. Darüber hinaus hängt CTD (70–134 aa) hauptsächlich mit der Klemmfunktion zusammen, und separate 1–83aa- und CpxI-CTD können das Hemmsignal effizient wiederherstellen, das mit den Funktionen von CpxI in voller Länge identisch ist (Abb. 5). Der Cpx-C-Terminus konkurriert mit SNAP25-SN1 um die Bindung an den SNARE-Komplex und stoppt dadurch die fortschreitende Bildung des SNARE-Komplexes vor der Auslösung31. Unsere Studie ergab, dass die Wiederherstellung der Funktion von Cpx in voller Länge eine hohe Konzentration an CpxI-CTD erfordert und ein reichlich vorhandenes CTD-Peptid die Hemmfunktion von CpxI31 verstärken kann.

CpxI klemmt die vormontierten SNARE-Komplexe in den „Linker-offenen Zustand“, der durch ein magnetisches Pinzettenexperiment gezeigt wurde32. Der SNARE-Komplex befindet sich jedoch nicht in einem funktionsfähigen Zustand, wenn das CpxI mit dem SNARE-Komplex vormontiert ist. Das Entpacken vormontierter SNARE-Komplexe erfolgte bei einem höheren Kraftniveau von durchschnittlich etwa 2 pN unter Einschluss von CpxI32. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Experiment mit optischen Einzelmolekülpinzetten die Untersuchung der Faltungsdynamik des SNARE-Komplexes in einem funktionellen Zustand. Unser Experiment mit optischen Einzelmolekülpinzetten legt nahe, dass CpxI den „C-terminal stabilisierten Zustand“, den „mittelgeklemmten Zustand“ und den „C-terminal blockierten Zustand“ einführen kann (Abb. 1, 4 und 5). Um die kritische Domäne für jeden Signaltyp zu bestimmen, sind die Signalvorkommen für die Wechselwirkung von SNARE mit drei repräsentativen Fragmenten in CpxI, dh 1–83 aa, 26–83 aa, 83–134 aa, in Abb. 6a zusammengefasst.

eine Zusammenfassung der Signalrate des SNARE-Komplexes bei Vorhandensein verschiedener Verkürzungen. Mit der Einbeziehung des CTD (vergleiche Spalte 5 mit Spalte 3) erhöht sich der Gesamtanteil des C-terminal blockierten Zustands (grüner Teil) und des mittelgeklemmten Zustands (rosa Teil), und unterdessen mit der Entfernung des NTD (vergleiche Spalte). 4 bis Spalte 3) nimmt der Anteil des C-terminal stabilisierten Zustands (violetter Teil) ab. Der gepaarte t-Test wurde angewendet, um die Statistiken mit einem p-Wert von *p < 0,02, **p < 0,03 und ***p < 0,0001 auszuwerten. b Modelle der Klemmfunktion von Complexin. (1) AH-Direktbindungsmodell. (2) AH-Konkurrenzmodell. Unsere vorhandenen Daten bevorzugen das (3)CTD-Gesamtmodell.

Darüber hinaus zeigte sich die mechanische Spannung an einzelnen vormontierten SNARE-Komplexen nur in einem engen Bereich, nämlich zwischen 13 und 16 pN. Unser Einzelmolekülexperiment legt jedoch nahe, dass das Zusammenspiel von CpxI in einem breiteren Kraftbereich von 5 bis 40 pN besteht. Das CH in CpxI kann auch das Vier-Helix-Bündel des vormontierten SNARE-Komplexes stabilisieren. Unsere dynamische Studie mit dem funktionellen SNARE zeigt jedoch, dass das CpxI-CH weder den SNARE-Komplex stabilisieren noch funktionell an den SNARE-Komplex binden konnte. Unsere Beobachtung steht im Einklang mit den In-vitro-Analysen von Rothman und Kollegen in Hela-Zellen, die eine Region mit den Aminosäuren 26–83 von CpxI als „minimale Klemmdomäne“ des Proteins abgrenzten.

Die Studie mit magnetischen Pinzetten legt nahe, dass die Deletion der C-terminalen Domäne keinen nennenswerten Einfluss auf einen der Aspekte der Cpx-Funktion hatte. Unsere Studie liefert jedoch einen direkten Beweis für die aktive Rolle von CpxI CTD bei der Klemmfunktion zur Hemmung der Membranfusion (Abb. 6a). .

In Gegenwart von CpxI voller Länge kann der SNARE-Komplex in drei Arten von Signalen eingeführt werden. Für den C-terminal blockierten Zustand änderte sich die Verteilung der SNARE-Komplexe von 2 bis 5 Zuständen auf 3 bis 5 Zustände (Abb. 2a – d), was bedeutet, dass der reversible Zusammenbau und Abbau auf den N-Terminus und den Übergang beschränkt ist des C-Terminus ist nicht zulässig (C-terminal blockierter Zustand). Im mittelgeklemmten Zustand fand die dynamische Faltung des SNARE-Komplexes in dieser Situation nur zwischen 3 und 4 Zuständen statt (Abb. 2a, b, d). Der SNARE-Komplex kann auch nach Zugabe von CpxI im C-terminal stabilisierten Zustand bleiben (C-terminal stabilisierter Zustand, Abb. 2a, b, d). Dementsprechend haben sich SNARE-Komplexe durch die Hinzufügung von CpxI vom Springen zwischen 2–5 Zuständen zu einer Aufrechterhaltung nur im Zustand 2 verändert.

Die 1–83 Aminosäuren von CpxI können die vier Helixbündel des SNARE-Komplexes am C-Terminal kraftvoll und dominant stabilisieren (Abb. 3, 1–83 Aminosäuren in Abb. 6a). Die Wahrscheinlichkeit für einen C-terminal blockierten Zustand steigt, sobald die NTD (1–26 aa) entfernt wird (26–83 aa in Abb. 6a), begleitet von einer Hemmung des C-terminal stabilisierten Zustands. Die CTD (83–134 aa) von CpxI blockiert jedoch überwiegend den C-Terminus von SNARE (83–134 aa, in Abb. 6a). 1–83 Aminosäuren von CpxI reichen im Vergleich zu CpxI voller Länge aufgrund des Fehlens von CTD nicht aus, um die C-terminale Reißverschlussbildung des SNARE-Komplexes zu blockieren.

Die Bindung zwischen CH und SNARE ist die Voraussetzung für die Klemmfunktion. Es wurde eine Reihe von Modellen vorgeschlagen, um die Wechselwirkung zwischen AH und dem SNARE mit halbem Reißverschluss zu erklären33,34. Unser Einzelmolekülexperiment zur Wechselwirkung verschiedener Fragmente des CpxI- und SNARE-Komplexes liefert Einzelmolekülunterstützung für das AH-Bindungsmodell (Abb. 6b1) und nicht für das AH-Konkurrenzmodell mit VAMP-C-Terminus (Abb. 6b2). Dies steht auch im Einklang mit dem Co-Kristallisationsexperiment, das darauf hindeutet, dass Cpx an den C-Terminus von VAMP bindet und nicht konkurriert33.

Die Kontroverse zwischen diesen beiden Modellen (Abb. 6b1, 2) betrifft die Bindungsstelle von CpxI AH. Experimente mit voller Länge legen nahe, dass der SNARE-C-Terminus nach der Zugabe von CpxI stabilisiert/blockiert (geklemmt) werden kann und die CpxI-Fragmente 1–83 aa nur den C-Terminus des SNARE-Komplexes stabilisieren können. Wenn das CpxI in voller Länge die Klemmfunktion (C-terminaler blockierter Zustand) durch ein konkurrierendes Modell realisiert (Abb. 6b2), befindet sich die Bindungsstelle von CpxI AH auf t-SNARE ohne VAMP-C-Terminus (Vc). Wenn Vc zurück zum Vier-Helix-Bündel gebunden wird, gibt es im C-terminal stabilisierten Zustand keine Bindungsstelle für CpxI AH.

Wenn dagegen das CpxI voller Länge die Klemmfunktion (C-terminaler blockierter Zustand) durch das direkte Bindungsmodell realisiert (Abb. 6b1), befindet sich die Bindungsstelle von CpxI AH auf Vc. Wenn Vc zurück zum Vier-Helix-Bündel gebunden wird, befindet sich die Bindungsstelle für CpxI AH immer noch im C-terminal stabilisierten Zustand. Darüber hinaus haben wir für die Klemmfunktion vorgeschlagen, dass CpxI CTD den C-Terminus des SNARE-Komplexes einfügt, um mit Vc oder t-SNARE (bevorzugt t-SNARE, (CTD-Komplettmodell in Abb. 6b3)) anstelle von CpxI AH (AH) zu konkurrieren Konkurrenzmodell in Abb. 6b2), was durch unsere unten aufgeführten Daten gestützt wird.

Die 1–83 Aminosäuren von CpxI können die vier Helixbündel des SNARE-Komplexes stark stabilisieren (Abb. 3). Sobald das komplementäre Fragment 83–134 aa (hauptsächlich Teil von CTD, ohne CH) injiziert wurde, zeigten 18 von 27 SNARE-Komplexen (67 %) keine Veränderung (zweite Spalte von Abb. 6a, Definition der Signalrate in Zusatzinformationen 7). ), was eine Negativkontrolle für die Experimente in Abb. 5 war. Die 1-83 aa stabilisieren überwiegend das SNARE am C-Terminus (1-83 aa in Abb. 6a). Die Wahrscheinlichkeit für einen C-terminal blockierten Zustand steigt, sobald die NTD (1–26 aa) entfernt wird (26–83 aa in Abb. 6a), begleitet von einer Hemmung des C-terminal stabilisierten Zustands. Die CTD (83–134 aa) von CpxI blockiert jedoch überwiegend den C-Terminus von SNARE (83–134 aa, in Abb. 6a). 1–83 Aminosäuren von CpxI reichen im Vergleich zu CpxI voller Länge aufgrund des Fehlens von CTD nicht aus, um die C-terminale Reißverschlussbildung des SNARE-Komplexes zu blockieren.

Ein Experiment mit einem Mischer von CpxI-Fragmenten (83–134 aa und 1–83 aa) legt nahe, dass der SNARE-C-Terminus stärker blockiert wird, wenn die CpxI-CTD (83–134 aa) zunimmt, während der Anteil des C-terminalen stabilisierten Zustands abnimmt ( Abb. 5c). Darüber hinaus kann die Klemmfunktion von Cpx durch Fragment 1-83 aa von CpxI und dessen CTD als separate Fragmente in vitro wiederhergestellt werden (Abb. 5c, letzte beiden Spalten). Daher ist keine physische Kontinuität über die gesamte Länge von CpxI erforderlich, um die Klemmfunktion einzurichten. CTD von CpxI hemmt den vollständigen Reißverschluss des SNARE-Komplexes. Zusätzlich dazu, dass CH für die direkte Kombination von Cpx und SNARE verantwortlich ist, ist CTD für die Hemmung der C-terminalen Anordnung von SNARE-Komplexen verantwortlich. Mittlerweile ist es durchaus sinnvoll, dass AH mit dem C-terminalen VAMP kombiniert wird, das weit von t-SNARE entfernt ist. Beim Eintreffen des Reizsignals, das die Membranfusion erleichtert, wird diese Klemmfunktion von CTD entfernt, CH behält weiterhin die Grundbindung bei, AH kann mit VAMP C-Terminus näher am SNARE-Komplex zusammengebaut werden, während NTD seine Rolle als Erleichterung übernimmt, und Gemeinsam stabilisieren sie den zusammengesetzten SNARE-Komplex mit vier Spiralbündeln. Damit der zusammengesetzte Komplex nicht sofort durch NSF abgebaut wird, bis die Freisetzung des Vesikelinhalts abgeschlossen ist.

Unsere Einzelmolekülbeobachtung ergab zwei Funktionen des CpxI während der Interaktion mit dem SNARE-Komplex. CpxI voller Länge klemmt den SNARE-Komplex ohne Ca2+ in einen halbgeschlossenen Zustand, während CTD sich wieder in die Klemme zurückfaltet (CTD könnte eine helikale Konformation haben). Dann unterstützen NTD und Synaptotagmin den Zusammenbau des SNARE-Komplexes und stabilisieren das Vier-Helix-Bündel des SNARE-Komplexes, um die Neurotransmitterfreisetzung zu realisieren.

Zusammenfassend liefert das Experiment mit optischen Pinzetten direkte Einzelmolekülbeweise für die Wechselwirkung zwischen CpxI und dem SNARE-Komplex im Funktionszustand, der den tatsächlichen physiologischen Zustand nachahmt. Wir haben die optische Dual-Trap-Pinzette mit Differentialerkennung gebaut und die unterschiedliche Faltungskinetik von SNARE-Komplexen in Abwesenheit und Anwesenheit von Wildtyp- und mutiertem/verkürztem CpxI gemessen. Eine Reihe synthetischer kurzer Fragmente von CpxI interagiert mit der SNARE-Anordnung. Insbesondere die Region 1–83 aa von CpxI kann das Vier-Helix-Bündel von SNARE-Motiven stabilisieren (erleichtern), und die Fähigkeit von CpxI, den SNARE-Komplex zu stabilisieren, hängt entscheidend von seiner NTD ab. Darüber hinaus können separate 1-83aa- und C-terminale Domänen von CpxI das Hemmsignal des CpxI voller Länge effizient wiederherstellen. Die Region mit 26–83 aa in CpxI ist die „minimale Klemmdomäne“ des Proteins27,28. Die Cpx-NTD haben entscheidenden Einfluss auf die Erleichterungsfunktion von Cpx, während Cpx-CTD eine aktive Rolle bei der Klemmfunktion spielt. Insgesamt lieferten unsere Ergebnisse Einblicke in die grundlegenden Mechanismen der Exozytose. Insbesondere arbeiten mehrere Domänen zusammen, um sicherzustellen, dass das CpxI in voller Länge als durch Kalzium ausgelöster molekularer Schalter fungiert – es klemmt den SNARE-Komplex im halbgeschlossenen Zustand im vorbereiteten Zustand des Vesikels fest und beschleunigt den SNARE-Komplex, um den Zusammenbau vollständig zu vollenden. gefalteter Zustand als Reaktion auf (z. B. Ca2+-ausgelöste) Reize im physiologischen Zustand. Wir gehen davon aus, dass die optischen Doppelfallenpinzetten weiterhin zur Bekämpfung wichtiger Krankheiten wie der Alzheimer- und der Huntington-Krankheit eingesetzt werden, indem der winzige fehlgefaltete Zustand unter mechanischer Spannung verfolgt wird.

Der -6-schichtige vernetzte synaptische SNARE-Komplex besteht aus VAMP2 (1-92, C2A, Q36C), Syntaxin 1 (172-265, C173A, L209C) und SNAP25 (1-206). Substitutions- oder Verkürzungsmutationen in SNARE-Proteinen und Cpx (C105A, 1-83, 26-83, 26-134, 83-134) wurden durch Overlap-Extension-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung entsprechender Primer erzeugt, die die gewünschten nicht homologen Sequenzen enthielten35. Alle Mutationen wurden durch DNA-Sequenzanalyse (BioSune, China) bestätigt. Gene, die Syntaxin und VAMP2 sowie den oben genannten Cpx entsprechen, wurden durch TA-Klonierung in pET-SUMO-Vektoren eingefügt. Die Proteine ​​wurden dann in E. coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert und wie im Handbuch des ChampionTM pET SUMO Expression System (Invitrogen) beschrieben gereinigt. Typischerweise wurden E. coli-Zellpellets in 25 mM HEPES, 400 mM KCl, 10 % Glycerin, 10 mM Imidazol, pH 7,7 (25 mM HEPES, 800 mM NaCl, 5 % Glycerin, 2 mM β-Me, 0,2 % Triton) resuspendiert X-100, pH 7,5 für Cpx) und durch Ultraschallbehandlung auf Eis aufgebrochen, um klare Zelllysate zu erhalten. Die Lysate wurden dann durch Zentrifugation gereinigt. Die SNARE-Proteine ​​im Überstand wurden an Ni-NTA-Harz gebunden und durch Erhöhung der Imidazolkonzentration auf bis zu 20 mM gewaschen. Das Syntaxin-Protein wurde in vitro durch das Biotin-Ligase-Enzym (BirA) wie beschrieben biotinyliert (Avidity, CO). Schließlich wurden die His-SUMO-Tags auf beiden Proteinen direkt auf Ni-NTA-Harz gespalten, indem die markierte SNARE-Proteine/Harz-Aufschlämmung mit SUMO-Protease (mit einem Protein-zu-Protease-Massenverhältnis von 100:1) über Nacht bei 4 °C inkubiert wurde . Die SNARE-Proteine ​​wurden im Durchfluss gesammelt, während der His-SUMO-Tag am Harz zurückblieb. SNAP25 wurde vom pET-28a-Vektor exprimiert und über seinen N-terminalen His-Tag gereinigt. Alle SNARE-Proteine ​​wurden in Gegenwart von 2 mM TCEP gereinigt, um unerwünschte Vernetzung zu vermeiden. Peptide von Cpx (48–73 aa) wurden von Yochem Biotech synthetisiert. Alle Cpx wurden vor dem optischen Pinzettenexperiment in den HEPES-Puffer (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,02 % CA630, pH 7,4) übertragen.

Ternäre SNARE-Komplexe wurden durch Mischen von Syntaxin-, SNAP25- und VAMP2-Proteinen im Molverhältnis 3:4:5 in 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM TCEP, pH 7,7 gebildet und die Mischung 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Hier wird das TCEP eingeführt, um die Bildung von Polymer durch die Disulfidbindung zwischen mehreren SNARE zu vermeiden. Die Bildung des ternären Komplexes wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigt. Überschüssige SNARE-Monomere oder binäre Komplexe wurden aus dem ternären Komplex durch weitere Reinigung durch Ni-NTA-Harz unter Verwendung des His-Tags am SNAP25-Molekül entfernt. Eine mittlere intramolekulare Vernetzung um die −6-Schicht zwischen VAMP2_V57C und Syntaxin_L222C erfolgte bei 34 °C, 300 U/min, 16 Stunden bei einer niedrigen Konzentration von 100 mM in Phosphatpuffer, 0,5 M NaCl, pH 8,5 ohne TCEP. Dann wurde der 2.260 bp große DNA-Anteil, der eine aktivierte Thiolgruppe an seinem 5'-Ende enthielt, zu der Lösung des SNARE-Komplexes gegeben, die gerade auf mehr als 70 μM konzentriert wurde, mit einem molaren Verhältnis von SNARE-Komplex zu DNA-Anteil von 20:1. Die intermolekulare Vernetzung erfolgte im Freien zwischen VAMP2 und dem DNA-Griff bzw. in 100 mM Phosphatpuffer, 0,5 M NaCl, pH 8,5. Der DNA-Griff enthält am anderen Ende auch zwei Digoxigenin-Einheiten. Sowohl die Thiolgruppe als auch die Digoxigenin-Einheiten am Griff wurden durch Primer in die PCR-Reaktion eingeführt. Der Überschuss an SNARE-Komplexen in der Vernetzungsmischung wurde entfernt, nachdem die richtigen SNARE-Komplex-DNA-Konjugate an die mit Anti-Digoxigenin beschichteten Perlen gebunden wurden.

Die Laserquelle ist ein Dauerstrichlaser mit einer zentralen Wellenlänge von 1064 nm (J20I-BL-206C, angepasst mit 10 m Faserbündel, Spectra-Physics). Der Laser wurde mit einem elektrooptischen Isolator (IO-3-1064-VHP, Thorlabs) von der Rückreflexion isoliert, um Schäden und Destabilisierung des Laserhohlraums zu verhindern. Eine Halbwellenplatte (HW1) in Kombination mit einem polarisierenden Strahlteiler (PBS1) steuert die Gesamtleistung, die an die optische Dual-Trap-Pinzette geliefert wird. Eine zweite Halbwellenplatte (HW2) regelt das Leistungsverhältnis zwischen zwei Laserfallen. Das erste Teleskop erweitert den Strahl auf einen Durchmesser von ca. 4 mm. Der aufgeweitete Strahl wurde dann durch ein Paar Polarisationsstrahlteiler (PBS2 und PBS3) geteilt und kombiniert. Ein Strahl bleibt fixiert, während der andere Strahl mithilfe eines beweglichen Spiegels gesteuert wird, der von einer Piezostufe angetrieben wird (Nano-MTA2X, MadCity Labs Inc). Ein zweites Teleskop T2 erweitert den Strahldurchmesser um das Doppelte und verlagert den Piezospiegel in die hintere Brennebene (BFP) des Einfangobjektivs (OB1, NA = 1,2, UPLSAPO60XWIR-2, Olympus). Um die Erkennungseffizienz zu maximieren, haben wir hier zwei identische Ziele (OBJ1 und OBJ2) zum Einfangen und Erkennen verwendet. Beide Objektive sind für eine hohe Transmission (>80 %) bei der Einfangwellenlänge (1064 nm) optimiert.

Die Positionserkennung wurde durch zwei positionsempfindliche Detektoren (PSDs, DL100-7 PCBA3, Pacific Silica) durchgeführt, die am BFP des Erkennungsobjektivs (OB2) konjugiert waren. Zur Unterstützung des Experiments wurde ein Hellfeldmikroskop zusammen mit der optischen Doppelfallenpinzette ausgerichtet. Die Hellfeldbeleuchtung erfolgte durch eine Laser emittierende Diode (LED) und wurde in Echtzeit durch eine ladungsgekoppelte Kamera (CCD) (scA640-74fc, Basler) überwacht. Die beiden Laserfallen wurden durch Fokussierung zweier orthogonal polarisierter 1064-nm-Laserstrahlen (Abb. 1a) mit einem Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Transmission erzeugt. Die optische Pinzette mit Doppelfalle kann Kraft auf ein angebundenes einzelnes Molekül ausüben, insbesondere fungieren die beiden Mikrokügelchen in der Falle als Kraft- und Verschiebungssensoren. Die Positionsspuren wurden durch zwei PSDs erfasst, die mit der BFP des Detektionsobjektivs mit Interferometrie in der hinteren Brennebene verbunden waren17. Die optischen Doppelfallen-Pinzetten wurden in einem von Umgebungsgeräuschen isolierten Raum mit guter Temperaturkontrolle und Klimaanlage installiert, insbesondere liegt die Temperaturschwankung unter 1 °C, während die Luftströmungsgeschwindigkeit am Auslass kleiner als 0,1 m/s ist die Klimaanlage. Um den Lärm durch den menschlichen Betrieb und das laute Instrument zu minimieren, wurde der Lasercontroller mit Lüfter außerhalb des Raums bewegt, wobei ein Multimode-Faserbündel Pumplicht in den Laserhohlraum leitet, und das Instrument wird bedient, z. B. Zugabe von Probe, Bindungsbildung, Kalibrierung und Messung außerhalb des Raums über eine einzige Labview-Schnittstelle. Das Instrument arbeitete im hochauflösenden Passivmodus, wobei die Position von zwei Fallen während der Aufzeichnung stationär blieb. Sobald eine Erhöhung der aufgebrachten Kraft erforderlich war, trennt sich die bewegliche Falle durch den Piezospiegel weiter von der stationären. Obwohl er beweglich ist, ist der Strahlfleck auf der hinteren Brennebene der Objektive stationär, wobei die Intensitätsverteilung von der Position der eingefangenen Mikrokügelchen abhängt. Daher können die optischen Pinzetten anhand der Leistungsspektrumdichte der Positionssignale kalibriert werden.

Hier ist \(\alpha\) die Kraftkonstante, die in unserem Experiment typischerweise zwischen 0,01 und 0,8 pN/nm liegt, die Umwandlungskonstante \(c\) liegt zwischen 0,1 und 3 mV/nm und \(\beta =6 \pi r\eta\) ist ein bekannter Luftwiderstandsbeiwert. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur (22 °C) im HEPES-Puffer (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,02 % CA630, pH 7,4) durchgeführt, ergänzt durch ein Sauerstofffängersystem36 (Ergänzungstabelle 2). Die Suspension der ersten mit Anti-Digoxigenin-Antikörper beschichteten Polystyrolkügelchen (Durchmesser 2,12 µm) wurde mit einem Aliquot der Mischung (vernetzter DNA-Griff und SNARE-Komplex) gemischt und die erste Perle in die rechte Optik gehalten fangen; Die zweite mit Streptavidin beschichtete Perle (Durchmesser 1,76 \(\mu\)m) wurde anschließend in einer anderen optischen Falle eingefangen und in die Nähe der ersten Perle gebracht, um die Protein-DNA-Bindung zwischen zwei Perlen zu bilden. Die Daten wurden bei 20 kHz erfasst, vor Ort auf 10 kHz gefiltert und zur Offline-Analyse auf einer Computerfestplatte gespeichert. Im Pulling-Relaxation-Experiment wurden einzelne SNARE-Komplexe durch Erhöhen (Verringern) des Fallenabstands bei einer konstanten Geschwindigkeit von 10 nm/s gezogen (entspannt). Zur Dynamikmessung wurde der Abstand der Fallen konstant gehalten, um die zeitlichen Spuren mit stochastischem Übergang aufzuzeichnen.

Die Verlängerung der Protein-DNA-Handle-Bindung, \(X\), ist die Summe der Verlängerungen des DNA-Handles, \({x}_{{DNA}}\), des entfalteten Polypeptidteils des SNARE-Komplexes, \ ({x}_{p}\) und die Kernstruktur h, d. h.

Dabei wird \(h\) als räumliche Länge des gefalteten Abschnitts (z. B. einer aufgerollten Spule) projiziert entlang der Zugrichtung angenommen, was ebenfalls zur endgültigen Dehnung beiträgt. Im vollständig gefalteten Zustand (nativer Zustand) wird \({h}_{0}=2{{{{{\rm{nm}}}}}}\) aus der Röntgenstruktur des Proteins20 bestimmt, wohingegen für den vollständig entfalteten Zustand \(h=0\) gilt. Und wenn man es in axialer Richtung zieht, ist \(h=0,15\times {N}_{s}\,{nm}\), wobei \({N}_{s}\) die Anzahl der Aminosäuren in der ist gefalteter Teil und ist der helikale Anstieg einer Aminosäure entlang der Helixachse.

Dem Experiment zufolge folgt die Dehnungskraft \({F}\) und die Protein-DNA-Griffbindung \(X\) zwischen den Innenflächen zweier Polystyrolkügelchen:

wobei \({k}_{{trap}}=\frac{{k}_{1}{k}_{2}}{{k}_{1}+{k}_{2}}\) ist die effektive Fallensteifigkeit, \({R}_{1}\) und \({R}_{2}\) sind die Radien zweier eingeschlossener Polystyrolkügelchen und \(D\) ist der Fallenabstand. Die Streckkraft \(F\), die Dehnung \(X\), die Perlenradien \({R}_{1}\) und \({R}_{2}\), die Fallensteifigkeit \({ k}_{1}\) und \({k}_{2}\), die DNA-Konturlänge, \({L}_{{DNA}}=768{{{{{\rm{nm}} }}}}\), und der Fallenabstand \(D\) kann aus dem Experiment ermittelt werden.

Um die Änderung der Konturlänge des SNARE-Cpx-Komplexes zu charakterisieren, wurden Entfaltungs- und Rückfaltungsspuren an das wurmartige Kettenmodell angepasst. Für den DNA-Griff wird die Verlängerung xDNA als Funktion der Dehnungskraft F durch das Marko-Siggia-Modell37,38 beschrieben.

wobei \({P}_{{DNA}}\) und \({L}_{{DNA}}\) die persistenten bzw. Konturlängen von dsDNA sind und \({k}_{B}\ ) ist die Boltzmann-Konstante. In ähnlicher Weise kann die Kraft für den entfalteten Polypeptidanteil des SNARE-Komplexes wie folgt formuliert werden:

wobei F und \({x}_{p}\) die Spannung bzw. Ausdehnung des entfalteten Polypeptids sind. Die Konturlänge des entfalteten Polypeptids \({l}_{p}\) hängt mit der Anzahl N der Aminosäuren im Polypeptid zusammen, die als \({l}_{p}=0,4\times N\) beschrieben wird. , wobei 0,4 nm die kristallographische Konturlänge pro Aminosäure ist39,40. Und \({P}_{P}\) ist die Persistenzlänge des entfalteten Polypeptids. \({k}_{B}T=4.1\,{pN}\cdot {nm}\) ist die Energieeinheit bei Raumtemperatur.

Um den Faltungsweg des Proteins zu charakterisieren, wird die Ausdehnung des SNARE-Komplexes in jedem Zustand vom Modell berechnet. Für jeden Zustand besteht die Erweiterung aus zwei Teilen: der Erweiterung des entfalteten Polypeptids \({l}_{{ir}}\) (i = 1, 2, 3 oder 4), die durch die Marko-Methode berechnet werden kann. Siggia-Formel und die Verlängerung des gefalteten Teils. Wie oben beschrieben, außer \({l}_{p}\), \({P}_{{DNA}}\) und \({P}_{P}\), sind alle anderen Parameter in Gleichungen . (1)–(4) können experimentell oder theoretisch erhalten werden. Daher könnten wir die experimentelle Erweiterung an den Kraftbereich jeder Region (oder jedes Zustands) in FEC anpassen, um deren am besten angepasste Werte zu erhalten. Die Anpassung erfolgt nach der Mittelwertfilterung der FECs in einem Zeitfenster von 11 ms. Die Persistenzlänge \({P}_{{DNA}}\) und \({P}_{P}\) sind für jedes Molekül mehr oder weniger unterschiedlich, daher bestätigen wir zunächst diese beiden Parameter vor jeder FEC-Anpassung Probe. Die FEC-Region des vollständig entfalteten Zustands wird zunächst mit \({P}_{{DNA}}\) (10–50 nm) und \({P}_{P}\) (0,5–0,9 nm) als Anpassung angepasst Parameter, während die bekannte Konturlänge des vollständig entfalteten Proteins als fester Parameter verwendet wird. Dann werden die am besten passenden \({P}_{{DNA}}\)- und \({P}_{P}\)-Werte als feste Parameter in anderen FEC-Regionen oder -Zuständen verwendet, in denen die Konturlänge lP beträgt angebracht werden. Angesichts der Parameter der Persistenzlänge von DNA und Protein können daher die Strukturinformationen von Proteinen aus der angepassten Konturlänge des entfalteten Polypeptids gemäß Gleichungen abgeleitet werden. (2)–(5).

Die HMM-Analyse wurde normalerweise für die gesamte Verlängerungszeit-Trajektorie durchgeführt (dauerte typischerweise 1–200 s), nachdem die Trajektorie auf 5 kHz oder 1 kHz durchschnittlich gefiltert wurde. Wir haben die Anzahl der Zustände ausgewertet, indem wir die Histogrammverteilung der Erweiterung mit mehreren Gaußschen Funktionen angepasst haben. Anschließend wurden die Anpassungsparameter im HMM mit einem Vier-Zustands-Übergangsmodell unter Verwendung eines Gradientenabstiegs weiter optimiert. Die HMM-Analysen lieferten aus den experimentellen Kurven die entsprechenden am besten geeigneten Parameter, wie z. B. die Gleichgewichtskraft und die Dehnungsänderung.

Die Fragmente oder das vollständige CpxI interagieren mit dem SNARE-Komplex, und die Erweiterungsspur des SNARE-Komplexes kann drei verschiedene Zustände anzeigen, nämlich den C-terminalen stabilisierten Zustand (CT), den mittleren geklemmten Zustand (MC) und den C-terminalen Zustand Blockierter Zustand (CB). Hier wurde die Wahrscheinlichkeit für jeden Zustand als Signalrate definiert.

Hier repräsentieren \(i={CT},{MC},{CB}\) und CT, MC, CB jeweils C-terminal stabilisierte, mittelgeklemmte bzw. C-terminal blockierte Zustände. Diese Definition wurde verwendet, um die Signalrate in Abb. 4d und Abb. 5c im Haupttext zu verarbeiten. Insbesondere gab es in Abb. 5a nur einen C-terminal inhibierten Zustand für CpxI 48-73aa.

Denn wir injizierten als Kontrolle nur Puffer (erste Spalte in Abb. 6a) durch den Proteinkanal, und die Mehrheit (81 % der 31 getesteten Moleküle) zeigte nach der Injektion keine Veränderung. Und sobald das Fragment 83–134 aa (größtenteils Teil von CTD, ohne CH) injiziert wurde, zeigten 18 von 27 SNARE-Komplexen keine Veränderung (zweite Spalte von Abb. 6a), was eine Negativkontrolle der Experimente in Abb. 5 darstellte. In Abb. 6a haben wir die Signalrate definiert als:

\(i={CT},{MC},{CB},{NC}\). Hier stehen CT, MC, CB und NC für C-terminal stabilisierte, mittelgeklemmte, C-terminal blockierte Zustände bzw. No Change-Moleküle.

Der gepaarte t-Test wurde angewendet, um die Statistiken mit einem p-Wert von *p < 0,04, **p < 0,002 und ***p < 10-8 auszuwerten. Die Stichprobengrößen betrugen mehr als n = 30 biologisch unabhängige Proben.

Ergänzende Informationen finden Sie auf der Website des Herausgebers.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Die benutzerdefinierten LabVIEW- und MATLAB-Codes, die für die Datenerfassung und -analyse verwendet werden, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem National Center for Protein Science in Shanghai für die Nutzung des Instruments. TH dankt Dr. Y. Gao für seine Hilfe beim SNARE-Aufbau und beim Einzelmolekülexperiment. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31571346, 31771432) unterstützt. YR dankt Shanghai und der Fudan-Universität für ihre Unterstützung.

Staatliches Schlüssellabor für Molekularbiologie, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, 200031, China

Tongrui Hao, Nan Feng und Jiaquan Liu

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Tongrui Hao & Nan Feng

Nationale Einrichtung für Proteinwissenschaft in Shanghai, Zhangjiang Lab, Shanghai Advanced Research Institute, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, 201210, China

Fan Gong & Yang Yu

Institut für translationale Hirnforschung, Shanghai Medical College, Fudan-Universität, Shanghai, 200032, China

Yu-Xuan Ren

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TH, NF und FG reinigten das Protein und sammelten die Einzelmoleküldaten; TH, NF, YY und YR analysierten die Daten; YR, FG und YY bauten das Instrument; JL bot umfassende Beratung und Unterstützung; TH und YR haben das Manuskript entworfen und alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Tongrui Hao, Jiaquan Liu oder Yu-Xuan Ren.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Maria Bykhovskaia und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Marco Fritzsche und Manuel Breuer. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hao, T., Feng, N., Gong, F. et al. Durch Complexin-1 regulierter Aufbau eines einzelnen neuronalen SNARE-Komplexes, sichtbar gemacht durch optische Einzelmolekülpinzetten. Commun Biol 6, 155 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04506-w

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Eingegangen: 27. Februar 2022

Angenommen: 19. Januar 2023

Veröffentlicht: 07. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04506-w

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